專利名稱：：控制水稻分蘗的基因及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域。具體涉及一種控制水稻分蘗的基因Osa-MIR156e，同時涉及該基因在轉(zhuǎn)基因水稻或轉(zhuǎn)基因水稻種子中的應(yīng)用。本發(fā)明采用正向遺傳學(xué)的方法，篩選T-DNA插入水稻突變體庫，克隆到控制水稻分蘗基因Osa-MIR156e，通過共分離檢測表明該基因與多分蘗突變表型是緊密連鎖的，及通過超量表達(dá)Osa-MIR156e基因，使正常水稻出現(xiàn)分蘗多的表型，證實了該基因的功能。還涉及含有該基因和具有該基因核心序列的該基因家族其它成員，以及含有其核心序列的其它DNA片段和其它物種的同源基因的載體和涉及利用該基因或其功能類似物調(diào)控植株的分蘗能力從而提高農(nóng)作物的產(chǎn)量。
背景技術(shù)：
：水稻作為重要的糧食作物，世界上三分之一以上的人以其為主食。同時，由于水稻具有基因組小、精細(xì)的遺傳和物理圖譜、相對容易的轉(zhuǎn)基因技術(shù)及與其它禾本科作物的共線性，而被視做模式植物。隨著包括水稻在內(nèi)的多種生物基因組測序的完成，人類開始進(jìn)入后基因組時代。全面開展功能基因組研究已成為生命科學(xué)的前沿領(lǐng)域。因此水稻功能基因的研究對社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展和生物學(xué)研究具有重大意義。為解決人口增長與耕地面積減少的矛盾，提高水稻單位面積產(chǎn)量仍是人們面臨的挑戰(zhàn)。50、60年代的矮化育種和70年代的雜交水稻培育是水稻增產(chǎn)的兩次革命，但近幾年來水稻的增產(chǎn)開始徘徊。1994年國際水稻所(IRRI)提出水稻理想株型育種，就是基于減少分蘗總數(shù)、提高成穗率、塑造穗大粒多一類新株型(NPT)的指導(dǎo)思想(KhushGS.Breakingtheyieldfrontierofrice.GeoJournal，1995，35(3)329-332)。我國的“水稻超高產(chǎn)育種計劃”實質(zhì)也離不開株型問題。在產(chǎn)量構(gòu)成因素穗數(shù)、穗粒數(shù)和粒重中，穗數(shù)的多少在很大程度上受制于分蘗的發(fā)生量，因而分蘗是影響水稻與小麥等主要農(nóng)作物單產(chǎn)的重要農(nóng)藝性狀之一。分蘗是單子葉植物在生長發(fā)育過程中形成的一種特殊的分枝特性。通常在每個節(jié)的葉腋都有一個分蘗芽，分蘗芽的分化發(fā)生較早，在葉原基長成帽狀時，其基部的一些細(xì)胞加速分裂形成隆起的蘗原基。這些蘗原基繼續(xù)分化生長成為分蘗芽。但只有位于莖稈基部不伸長節(jié)間上的分蘗芽才能夠伸長生長為分蘗；而莖桿上部伸長節(jié)間上的分蘗芽一般不伸長而處于休眠狀態(tài)。若環(huán)境條件適宜，從稻莖的下部節(jié)開始，自下而上這些分蘗芽都可發(fā)育成分蘗。在主莖上形成的分蘗稱為一級分蘗，一級分蘗上可形成二級分蘗，依次類推。因此，一株水稻的最高分蘗數(shù)是全部蘗次、蘗位上的分蘗長成的總和。在正常(野生型)水稻中，以一級與二級分蘗為主，更高級別的分蘗則很少形成。稻秧生長至4個葉片時進(jìn)入分蘗期。分蘗并非越多越好。后期分蘗一般是不能成穗的無效分蘗。品種具有早生快發(fā)特性則有利于提高分蘗的質(zhì)量，提高成穗率，從而提高水稻的產(chǎn)量。(李學(xué)勇等，水稻分蘗的分子機(jī)理研究。中國科學(xué)院院刊，2003(4)274-276；任翔等，水稻分蘗能力QTL的定位。武漢大學(xué)學(xué)報(理學(xué)版)，2003，49(4)533-537)。水稻分蘗是一個復(fù)雜的發(fā)育性狀。一般認(rèn)為，分蘗數(shù)目是多基因控制的數(shù)量性狀，其遺傳力往往較低，光照、灌溉、肥料、溫度等都會有很大影響。Wu等應(yīng)用動態(tài)基因定位法在重組自交系群體中定位了5個數(shù)量性狀座位(quantitativetraitlocus，QTL)(WuWRetal.，Time-RelatedMappingofQuantitativeTraitLociUnderlyingTillerNumberinRice.Genetics，1999，151297-303.)。Yan等應(yīng)用雙單倍體群體發(fā)現(xiàn)了多個分蘗相關(guān)QTL，但其中只有1個在整個分蘗期發(fā)揮作用。至今已發(fā)現(xiàn)了23個影響分蘗數(shù)目的數(shù)量性狀QTLs位點，分布在除第9、第10號之外的其余10條染色體上(YanJQetal.，QuantitativeTraitLociAnalysisfortheDevelopmentalBehaviorofTillerNumberinRice(OryzasativaL.)。TheorApplGenet，1998，97267-274.)。通過突變體來研究一些與植物生長、發(fā)育和其他性狀相關(guān)的基因已成為一種重要的基因功能研究手段。實際上通過傳統(tǒng)的化學(xué)誘變、輻射誘變以及新近采用的轉(zhuǎn)座子和T-DNA標(biāo)簽法均已分離到一批與植物發(fā)育調(diào)節(jié)相關(guān)的重要基因，但大部分研究只是對突變體進(jìn)行表型描述或基因初步定位，只有少部分克隆到基因。JohnDoebley等在1997年利用轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法分離到一個玉米草主莖腋生分枝數(shù)相關(guān)基因TB1(JohnDoebleyetal.，Theevolutionofapicaldominanceinmaize.Nature，1997，386485-488；MartienssenR.，Theoriginofmaizebranchesout.Nature，1997，386443.)。SchumacherK等1999年克隆到了控制番茄側(cè)枝發(fā)生基因LS(SchumacherKetal.，Thelateralsuppressor(LS)geneoftomatoencodesanewmemberoftheVHIIDproteinfamily.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1999，96290-295)。2003年GrebT等克隆到擬南芥的側(cè)枝抑制基因LAS(GrebTet.MolecularanalysisoftheLATERALSUPPRESSORgeneinArabidopsisrevealsaconservedcontrolmechanismforaxillarymeristemformation.GenesDev.，2003，171175-1178.)。而水稻分蘗控制基因MOCI的克隆是近年來在植物形態(tài)建成特別是側(cè)枝形成研究領(lǐng)域中最重要的進(jìn)展之一(LiXetal.，Controloftilleringinrice.Nature，2003，422618-621)。雖然目前已克隆到了一些控制植物分蘗的基因，但對植物分蘗的分子機(jī)理仍不清楚?，F(xiàn)在世界上許多國家都在創(chuàng)建各種突變體庫，以此為平臺克隆基因，這是一種很有效的方法，而更多的植物分蘗基因也有望通過此方法被分離克隆。本發(fā)明也是利用該方法克隆到控制水稻分蘗性狀的基因Osa-MIR156e。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是在于提供了一種控制水稻分蘗的基因Osa-MIR156e，如SEQ.ID.No.1所示的核苷酸序列，或具有其核心序列5′TGACAGAAGAGAGTGAGCAC3′的該基因家族其它成員，以及含有其核心序列的其它DNA片段。本發(fā)明的另一個目的在于提供一種控制水稻分蘗基因Osa-MIR156e在轉(zhuǎn)基因水稻中的應(yīng)用。本發(fā)明的再一個目的在于提供一種控制水稻分蘗基因Osa-MIR156e在轉(zhuǎn)基因水稻種子中的應(yīng)用。通過控制Osa-MIR156e基因或其同源基因在水稻中的表達(dá)量來控制水稻分蘗數(shù)，從而形成理想株型，達(dá)到增產(chǎn)的目的。本基因的克隆還對闡明MIR156基因家族的生物學(xué)功能有重要意義以及對植物分蘗的分子機(jī)理研究將有極大的推動作用。實現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)如下1.創(chuàng)建突變體庫(T0代)農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法創(chuàng)建水稻T-DNA插入突變體庫(T0代)。2.T1代分蘗性狀大田篩選從T0代突變體庫中選出3000份種子(T1代)，正常大田條件下種植，每份種20株(稱為1個家系)。觀察突變體分蘗數(shù)變化，共觀察到約100個家系有分蘗數(shù)突變。3.突變株系與T-DNA共分離檢測及T-DNA拷貝數(shù)初步分析。用PCR(polymerasechainreaction)方法檢測突變家系與T-DNA是否共分離，100個突變家系中有41個為PCR陽性共分離。并對每個共分離家系所種的20個單株做陽性檢測，大致估算T-DNA拷貝數(shù)，根據(jù)孟德爾遺傳規(guī)律單位點基因會出現(xiàn)3∶1分離，當(dāng)陽性∶陰性＝3∶1時為單拷貝。4.分離側(cè)翼序列對41個T-DNA共分離家系做Tail-PCR(LiuYG，WhittierRF.ThermalasymmetricinterlacedPCRAutomatableamplificationandsequencingofinsertendfragmentsfromP1andYACclonesforchromosomewalking.Genomics，1995，25674-681)分離側(cè)翼序列，有15個家系分離到側(cè)翼序列，分析側(cè)翼序列發(fā)現(xiàn)7個家系的側(cè)翼序列能很好的定位在水稻基因組上。5.根據(jù)側(cè)翼序列設(shè)計引物進(jìn)一步做共分離檢測根據(jù)側(cè)翼序列設(shè)計引物做進(jìn)一步共分離驗證，如圖2，A表示在插入位點上游設(shè)計的引物，B表示在插入位點下游設(shè)計的引物，C表示根據(jù)T-DNA內(nèi)部序列設(shè)計的引物。在T1代植株中，T-DNA純合植株只有A和C配對可以擴(kuò)增的出，因為有T-DNA插入A與B配對的產(chǎn)物太大無法得到擴(kuò)增片段，野生型的植株由于沒有T-DNA的插入，只有A和B配對可以得到產(chǎn)物，雜合植株則A和C配對以及A和B配對時都可以擴(kuò)增得到產(chǎn)物。如果突變性狀是隱性的，那所有突變株用A和B配對擴(kuò)不出的為共分離。如果突變性狀是顯性的，則所有突變單株用B和C配對都擴(kuò)出，正常單株用B和C配對都擴(kuò)不出的為共分離。PCR分析，結(jié)果7個家系中只有一個家系是共分離。其突變表型如圖3。PCR結(jié)果，如圖4其中泳道4，6，10，16，19，20為T-DNA純合；2，3，7，8，9，12，13，14為T-DNA雜合；1，5，11，15，17，18為T-DNA陰性。與田間表型對照，T-DNA純合植株表型為分蘗多、矮化、不育；T-DNA雜合植株表型為分蘗多、矮化、可育；T-DNA陰性植株表型為正常，表現(xiàn)出1∶2∶1分離。6.T2代進(jìn)一步做共分離驗證為了驗證該突變體的遺傳穩(wěn)定性及進(jìn)一步驗證共分離情況，又繁殖了一代即T2代，因為T1代中T-DNA純合突變無種子，只能種雜合子，結(jié)果出現(xiàn)預(yù)期的三種表型，而且符合1∶2∶1分離；正常單株的下一代沒有出現(xiàn)分離，仍然表現(xiàn)正常。同時PCR檢測表明T-DNA的插入與突變表型共分離。由此證明，這個突變體是由于這個T-DNA插入造成的單位點顯性突變。7.確定突變位點，獲得候選基因該突變體T-DNA插入水稻第4染色體，GenBank核苷酸數(shù)據(jù)庫(http//www.ncbi.nlm.nih.gov)中對應(yīng)的克隆號AL442115，插入該克隆第20054位堿基旁，分析插入位點附近基因發(fā)現(xiàn)，相距1156bp處有一個編碼miRNA基因Osa-MIR156e，其編碼的miRNA前體可形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，如圖5。8.Osa-MIR156基因的功能驗證超量表達(dá)Osa-MIR156基因驗證其功能。構(gòu)建超表達(dá)載體pU17310，采用農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，將超表達(dá)載體導(dǎo)入正常粳稻品種中花11，最后獲得超表達(dá)的組培苗100株，作為對照的由正常粳稻品種中花11愈傷分化的苗子30株，都種于大田，結(jié)果約有50％的超表達(dá)組培苗出現(xiàn)分蘗多，半矮，半不育的突變表型。說明Osa-MIR156e基因具有控制水稻分蘗的功能，同時還使水稻出現(xiàn)矮化和不育的表型。9.Osa-MIR156基因的應(yīng)用為解決人口增長與耕地面積減少的矛盾，提高水稻單位面積產(chǎn)量仍是人們面臨的挑戰(zhàn)。50、60年代的矮化育種和70年代的雜交水稻培育是水稻增產(chǎn)的兩次革命，但近幾年來水稻的增產(chǎn)開始徘徊。1994年國際水稻所(IRRI)提出水稻理想株型育種，就是基于控制水稻分蘗總數(shù)、提高成穗率、塑造穗大粒多一類新株型的指導(dǎo)思想。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法也可以是基因槍法或其它遺傳轉(zhuǎn)化方法超量表達(dá)控制水稻分蘗基因Osa-MIR156e在水稻中的表達(dá)量來提高水稻的分蘗數(shù)或著通過遺傳轉(zhuǎn)化方法抑制表達(dá)控制水稻分蘗基因Osa-MIR156e在水稻中的表達(dá)量來減少水稻分蘗數(shù)，達(dá)到控制水稻分蘗數(shù)的目的，形成理想株型。所以根據(jù)不同水稻品種的要求增加或減少水稻的分蘗數(shù)，形成理想的水稻株型，達(dá)到增產(chǎn)的目的?？刂扑痉痔Y基因Osa-MIR156e可以在轉(zhuǎn)基因水稻中應(yīng)用也可以在轉(zhuǎn)基因水稻種子中應(yīng)用，培育具有優(yōu)良水稻株型的品種。本發(fā)明的優(yōu)點和效果1.本基因的成功克隆進(jìn)一步證實了采用T-DNA標(biāo)簽法克隆基因的可行性，而且該方法克隆基因速度快，效率高。2.擬南芥基因家族ath-MIR156中的大部分基因雖已被克隆，但并不清楚其具體的生物學(xué)功能，本發(fā)明克隆的Osa-MIR156e基因?qū)λ痉痔Y有顯著的影響見圖3，這對闡明MIR156基因家族的生物學(xué)功能有重要意義。3.雖然目前已克隆到了一些控制植物分蘗的基因，但對植物分蘗的分子機(jī)理仍不清楚。而本發(fā)明克隆的Osa-MIR156基因能夠控制水稻的分蘗數(shù)，這對植物分蘗的分子機(jī)理研究將有極大的推動作用。4.Osa-MIR156基因不僅影響分蘗數(shù)，同時還使突變體表現(xiàn)出矮化和不育的表型，該基因的功能研究對于植物重要農(nóng)藝性狀的研究意義深遠(yuǎn)。5.該突變體使水稻分蘗數(shù)大大地提高，說明Osa-MIR156e基因?qū)Ω淖兎痔Y效果很明顯，通過基因工程技術(shù)提高或減弱Osa-MIR156e基因的表達(dá)量能夠控制植物分蘗或分枝的數(shù)量，從而有利于形成理想株型，達(dá)到增產(chǎn)的目的。圖1.創(chuàng)建突變體庫所用pSMR-J18R載體圖。圖2.根據(jù)插入位點設(shè)計引物驗證共分離示意圖。A表示在插入位點上游設(shè)計的引物，B表示在插入位點下游設(shè)計的引物，C表示根據(jù)T-DNA內(nèi)部序列設(shè)計的引物。在T1代植株中，純合突變體只有A和C配對可以擴(kuò)增的出，因為有T-DNA插入A與B配對的產(chǎn)物太大無法得到擴(kuò)增片段，野生型的植株由于沒有T-DNA的插入，只有A和B配對可以得到產(chǎn)物，雜合植株則A和C配對以及A和B配對時都可以擴(kuò)增得到產(chǎn)物。圖3.水稻多分蘗突變體表型。左T-DNA純合突變；中T-DNA雜和突變；右正常表型。圖4.根據(jù)插入位點設(shè)計引物驗證共分離的PCR結(jié)果。上一行引物A+B，下一行引物C+B，M表示2KBMaker，其中泳道4，6，10，16，19，20為T-DNA純合；2，3，7，8，9，12，13，14為T-DNA雜合；1，5，11，15，17，18為T-DNA陰性。與田間表型對照，T-DNA純合植株表型為分蘗多、矮化、不育；T-DNA雜合植株表型為分蘗多、矮化、可育；T-DNA陰性植株表型為正常，表現(xiàn)出1∶2∶1分離。|圖5.Osa-MIR156e基因，其編碼的miRNA形成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。圖6.T2代驗證共分離的PCR結(jié)果。上一行引物A+B，下一行引物C+B，M表示2KBMaker，泳道2，6，7，13，19，20，28，31，37，40為T-DNA純合植株；1，3，4，8，10，11，12，15，16，17，21，22，24，25，27，29，32，34，36，38，39為T-DNA雜合單株；5，9，14，18，23，26，30，33，35，為T-DNA陰性單株。與田間表型對照，T-DNA純合植株表型為分蘗多、矮化、不育；T-DNA雜合植株表型為分蘗多、矮化、可育；T-DNA陰性植株表型為正常，表現(xiàn)出1∶2∶1分離。圖7.超表達(dá)實驗所用pU1301載體圖。具體實施例方式實施例1分離克隆Osa-MIR156e基因1.創(chuàng)建突變體庫(T0代)所用載體pSMR-J18R，由澳大利亞CAMBIA實驗室(CenterfortheApplicationofMolecularBiologytoInternationalAgriculture)惠贈，如圖1，以農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)方式在粳稻品種中花11號(OryzasativaL.subsp.japonicacv.Zhonghua11)基因組中隨機(jī)插入T-DNA(含EnhancerTrap)(SpringerPS.GeneTrapsToolsforplantdevelopmentandgenomics.PlantCell，2000，121007-1020)創(chuàng)建突變體庫。突變體庫的構(gòu)建是按照Wu等(WuCetal.，Developmentofenhancertraplinesforfunctionalanalysisofthericegenome.PlantJ，2003，35418-427)所描述的方法構(gòu)建而成。目前約得到10萬株獨立轉(zhuǎn)化子。2.T1代分蘗性狀大田篩選從T0代突變體庫中選出3000份T1代種子，先在秧田劃5×8寸的格子播種，20天后再移栽至大田篩選。每份材料種2行，每行10株，共20株(為1家系)，行與行間間距8寸，株與株間間距5寸。從水稻分蘗期結(jié)束后，開始觀察每個家系分蘗數(shù)的突變情況。共觀察到約100個家系有分蘗數(shù)突變(變多或變少)。3.突變株系與T-DNA共分離檢測及T-DNA拷貝數(shù)初步分析。用PCR方法檢測突變家系與T-DNA是否共分離，即突變株必需是T-DNA陽性。所用引物GAL4-L5′AGACCGGCAACAGGATTCAATC3′，GAL4-R5′TTCGTCCAGGACAACGTGAACA3′，反應(yīng)體系的總體積為20μl，DNA模板1ul(約50ng)、1×Taq酶反應(yīng)緩沖液、25mMMgCL21.2ul、2mMdNTP1.5ul、10uM引物0.2ul、0.3單位Taq酶，加ddH20(無菌去離子水)至20μl。反應(yīng)程序為94℃變性5min，94℃45s、55℃45s、72℃1min30cycles，72℃延伸5min。擴(kuò)出的片段為T-DNA的一個片段，大小為611bp。100個突變家系中有41個為PCR陽性共分離。并對共分離家系所種的20個單株做陽性檢測，大致估算T-DNA拷貝數(shù)，根據(jù)孟德爾遺傳規(guī)律單位點基因會出現(xiàn)3∶1分離，當(dāng)陽性∶陰性＝3∶1時為單拷貝。4.分離側(cè)翼序列對41個T-DNA共分離家系按Liu等的Tail-PCR方法分離側(cè)翼序列(LiuYG，WhittierRF.ThermalasymmetricinterlacedPCRAutomatableamplificationandsequencingofinsertendfragmentsfromP1andYACclonesforchromosomewalking.Genomics，1995，25674-681)。利用CTAB法抽提突變體總DNA，方法如SAGHAI-MAROOF等(SAGHAI-MAROOFetal.，RibosomalDNAspacer-lengthpolymorphismsinbarleyMendelianinheritance，chromosomallocation，andpopulationdynamics.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1984，818014-8018)。根據(jù)轉(zhuǎn)化載體pSMR-J18R的T-DNA左側(cè)末端設(shè)計的嵌套式特異引物序列和引物在載體上對應(yīng)的位置如下LSP2(引物)5’-GAAGTACTCGCCGATAGTGGAAACC-3’6701-6677；LBT2(引物)5’-ATAGGGTTTCGCTCATGTGTTGAGCAT-3’6550-6524；LBT3(引物)5’-CCAGTACTAAAATCCAGATCCCCCGAAT-3’6447-6420。用于分離側(cè)翼序列的簡并引物及其序列為AD2a(引物)5’-(AGCT)GTCGA(GC)(AT)GA(AGCT)A(AT)GAA-3’。反應(yīng)體系為第一輪DNA模板1.0μl；10×buffer2.0μl；2MmdNTP2.0μl；25MmMgCl22.0μl；10μM特異性引物0.2μl；100μM簡并引物0.2μl；Taq酶1u；加ddH2O至20μl。第二輪DNA模板1.0μl；10×buffer2.0μl；2MmdNTP2.0μl；25MmMgCl22.0μl；50％甘油2.0μl；10μM特異性引物0.2μl；100μM簡并引物0.2μl；Taq酶1u；加ddH2O至20μl。第三輪DNA模板1.0μl；10×buffer2.0μl；2MmdNTP1.5μl；25MmMgCl21.2μl；50％甘油2.0μl；10μM特異性引物0.2μl；100μM簡并引物0.2μl；Taq酶1u；加ddH2O至20μl。反應(yīng)程序按照Liu等的方法進(jìn)行。反應(yīng)完成后，取第三輪反應(yīng)產(chǎn)物5μl在0.8％的瓊脂糖凝膠上檢測。采用低熔點瓊脂糖挖膠回收的方法純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物。純化方法為將第三輪PCR反應(yīng)產(chǎn)物在1％的低熔點瓊脂糖上電泳，把擴(kuò)增產(chǎn)物條帶從膠上切下放入1.5mlEppendorf離心管中，65℃水浴15min，加入等體積PH7.9苯酚，顛倒搖勻5min，13000r/min離心8min，取上清，加入等體積氯仿∶異戊醇(體積比24∶1)顛倒搖勻5min，13000r/min離心8min，取上清，加入1/10體積3M醋酸鈉(PH5.2)，2倍體積預(yù)冷的95％乙醇，混勻后置-20℃冰箱中20min以上，13000r/min離心15min，倒掉95％乙醇后再用75％乙醇浸洗沉淀，自然風(fēng)干，DNA沉淀溶于20μl無菌去離子水。把回收產(chǎn)物測序，測序引物序列和在載體上的位置為NTLB5(引物)5’-AATCCAGATCCCCCGAATTA-3’6437-6418，有15個家系分離到側(cè)翼序列，分析側(cè)翼序列發(fā)現(xiàn)有7個家系的側(cè)翼序列能很好的定位在水稻基因組上。5.根據(jù)側(cè)翼序列設(shè)計引物進(jìn)一步做共分離檢測根據(jù)側(cè)翼序列與水稻基因組的匹配情況，可以確定插入位點，在插入位點的兩邊設(shè)計一對引物A和B，及T-DNA上設(shè)計一條引物C，如圖2，A表示在插入位點上游設(shè)計的引物，B表示在插入位點下游設(shè)計的引物，C表示根據(jù)T-DNA內(nèi)部序列設(shè)計的引物。在T1代植株中，T-DNA純合植株只有A和C配對可以擴(kuò)增的出，因為有T-DNA插入A與B配對的產(chǎn)物太大無法得到擴(kuò)增片段，野生型的植株由于沒有T-DNA的插入，只有A和B配對可以得到產(chǎn)物，雜合植株則A和C配對以及A和B配對時都可以擴(kuò)增得到產(chǎn)物。如果突變性狀是隱性的，那所有突變株用A和B配對擴(kuò)不出的為共分離。如果突變性狀是顯性的，那所有突變單株用C和B配對都擴(kuò)出，正常單株用C和B配對都擴(kuò)不出的為共分離。最后分析結(jié)果，7個家系中只有一個家系是共分離。該共分離家系突變表型如圖3，其分離的側(cè)翼序列全長902bp如下tgccgatattagtaattaaaaaccctggcgagttgcttccgatcttgtacaggagcccagcaaattaaactcaagtaaaactagtgggggatatatatggactctgaaccgagagagggtggtaagtacgagcaccatgaatggaacagtggcccaacagtatcctacatttttggagccattgggggacaatgcatcgttgcaccattactccctactttgaatgccagagcgagatgtgaggtgttaattctcaagaacatggaggaccagcaggacagcagaagataactgactgatgataaggggaagccgctccaagcagatctgggtctcagtactgttcctgcctgtcctccttcctcctcctctctctcctccgatcctgatcatgtagctagctgatcttctacacacttgtgtgcttaattacgactgtaacactggatggggcgctacagtaagatgatcgaagctatgtatcaatttctaaacaagattaaaaagatgctcgatctagattgacattttctgacatgcccatgggagattgcctgcgactgattctgattaataccagtagcctagatgcaatcaatagcactagtatactagttgcatgttcctaccatgatggggaatgaatagaaagactgcctagtactagctagctagctagtcgactagcagctacgcactcttgcctaaatgcatgaaagaaatgtcgtcgtacttatttgaccgcaggagtattttgtaaacacgcaactgcatggcctgtaccttcctaccgtttcattgcataaaacctggattccaattggcaattccgtaccctggcattgtttttgactcattcccttaattggcaatatccaaagaaaccggaacgaattgttttc采用BLAST分析方法(AltschulSFetal.，Basiclocalalignmentsearchtool.J.Mol.Biol.，1990，215403-410)發(fā)現(xiàn)側(cè)翼序列與GenBank核苷酸數(shù)據(jù)庫中的克隆AL442115能夠很好的匹配，側(cè)翼序列的24-353，382-478分別和AL442115的20054-19726，19698-19605匹配，同源性高達(dá)97％。根據(jù)插入位點設(shè)計的引物序列為A(引物)5′CTTAGCCAAACTTCATTGTTATCTG3′。B(引物)5′AGTCGGTGTTGATGCCTGTAA3′。C(引物)5′AATCCAGATCCCCCGAATTA3′。PCR反應(yīng)體系的總體積為20μl，DNA模板1ul(約50ng)、1×Taq酶反應(yīng)緩沖液、25mMMgCL21.2ul、2mMdNTP1.5ul、10uM引物0.2ul、0.3單位Taq酶，加ddH2O至20μl。反應(yīng)程序為94℃變性5min，94℃45s、55℃45s、72℃1min30cycles，72℃延伸5min。PCR結(jié)果，如圖4，其中泳道4，6，10，16，19，20為T-DNA純合；2，3，7，8，9，12，13，14為T-DNA雜合；1，5，11，15，17，18為T-DNA陰性。與田間表型對照，T-DNA純合植株表型為分蘗多、矮化、不育；T-DNA雜合植株表型為分蘗多、矮化、可育；T-DNA陰性植株表型為正常，表現(xiàn)出1∶2∶1分離。說明該突變表型確實是T-DNA插入造成的。6.T2代進(jìn)一步做共分離驗證為了驗證該突變體的遺傳穩(wěn)定性及進(jìn)一步驗證共分離情況，又繁殖了一代即T2代。將T1代收獲的種子播種得到T2代，因為T1代中T-DNA純合突變無種子，只能種雜合子，結(jié)果出現(xiàn)預(yù)期的三種表型，即分蘗多、矮化、不育；分蘗多、矮化、可育以及正常3種，而且符合1∶2∶1分離。而正常單株的下一代沒有出現(xiàn)分離，仍然表現(xiàn)正常。同時PCR檢測表明T-DNA的插入與突變表型共分離，如圖6，泳道2，6，7，13，19，20，28，31，37，40為T-DNA純合植株；1，3，4，8，10，11，12，15，16，17，21，22，24，25，27，29，32，34，36，38，39為T-DNA雜合單株；5，9，14，18，23，26，30，33，35，為T-DNA陰性單株。與田間表型對照，T-DNA純合植株表型為分蘗多、矮化、不育；T-DNA雜合植株表型為分蘗多、矮化、可育；T-DNA陰性植株表型為正常，表現(xiàn)出1∶2∶1分離。由此證明，這個突變體是由于T-DNA插入造成的單位點顯性突變。7.確定突變位點，獲得候選基因，并進(jìn)行功能分析采用BLAST分析方法發(fā)現(xiàn)，該突變體T-DNA插入水稻第4染色體，對應(yīng)GenBank核苷酸數(shù)據(jù)庫中的克隆號為AL442115，插入該克隆第20054位堿基旁，分析插入位點附近基因發(fā)現(xiàn)，相距1156bp處有一個編碼miRNA基因Osa-MIR156e，其編碼的miRNA前體可形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，如圖5。Osa-MIR156e基因在水稻基因組中有多個同源基因，與擬南芥ath-MIR156基因?qū)儆谕换蚣易錗IR156。雖然在擬南芥中已克隆到基因家族ath-MIR156中的部分基因，但并不清楚其具體的生物學(xué)功能，且Osa-MIR156e基因在水稻中是否表達(dá)還沒證實(MatthewW.Rhoadesetal.，PredictionofPlantMicroRNATargets.Cell，2002，110513-520；BrendaJ.Reinhartetal.，MicroRNAsinplants.GENES&DEVELOPMENT，2002，1616-1626)。本發(fā)明克隆的Osa-MIR156e基因?qū)λ痉痔Y有顯著的影響，這對闡明MIR156基因家族的生物學(xué)功能有重要意義。另外Osa-MIR156基因不僅影響分蘗數(shù)，同時還使突變體表現(xiàn)出矮化和不育的表型，說明該基因具有多種功能。通過PCR方法擴(kuò)增到Osa-MIR156基因，并克隆到超表達(dá)載體，見實施例2。實施例2Osa-MIR156基因的功能驗證和應(yīng)用1.遺傳轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建所用載體是本實驗室構(gòu)建的pU1301。pU1301是在國際上常用的植物遺傳轉(zhuǎn)化載體pCAMBIA1301(Sun等，2004，Xa26，ageneconferringresistancetoXanthomonasoryzaepv.oryzaeinrice，encodingaLRRreceptorkinase-likeprotein.PlantJournal.37517-527)基礎(chǔ)上改建的，攜帶具有組成型和超量表達(dá)特征的玉米泛素啟動子的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化載體(圖7)。pCAMBIA1301載體由澳大利亞CAMBIA實驗室(CenterfortheApplicationofMolecularBiologytoInternationalAgriculture)惠贈。用PCR方法，直接從水稻基因組擴(kuò)目標(biāo)基因SEQ.ID.No.1，PCR反應(yīng)體系的總體積為20μl，水稻基因組DNA模板1ul(約50ng)、1×Taq酶反應(yīng)緩沖液、25mMMgCL21.2ul、2mMdNTP1.5ul、10uM引物各0.2ul、50％甘油2ul、0.3單位rTaq酶(Takara公司)，加ddH2O至20μl。反應(yīng)程序為94℃變性3min，94℃45s、55℃45s、72℃1min、35cycles，72℃延伸5min，擴(kuò)10管，收集PCR產(chǎn)物于1.5ml離心管純化，加等體積24∶1氯仿異戊醇，輕搖5分鐘，12000rpm離心15分鐘，吸上清，加2倍體積95％乙醇，1/10體積3M醋酸鈉(PH5.2)，-20℃放置30分鐘，12000rpm離心20分鐘，棄上清，加500ul75％乙醇放置5min，12000rpm離心5分鐘，棄上清，晾干，加75ulddH2O溶解。把純化的PCR產(chǎn)物及pU1301載體酶切，體系總體積100ul，PCR產(chǎn)物或載體質(zhì)粒75ul，限制性內(nèi)切酶BamH130U，限制性內(nèi)切酶Kpn130U，10XKbuffer5ul，ddH2O16ul，37℃酶切5小時。純化酶切產(chǎn)物，方法同上，最后加10ulddH2O溶解。連接反應(yīng)10ulPCR產(chǎn)物全部用于連接反應(yīng)，載體0.5ul，2UT4ligase，5Xbuffer3ul，總15ul體積，連接24小時。取1ul連接產(chǎn)物，電壓18000V，電轉(zhuǎn)到大腸桿菌DH10B，加800ulLB，復(fù)蘇45分鐘，取200ul涂于含卡那霉素的LA平板，37℃，過夜。挑單克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)抽質(zhì)粒，酶切驗證，酶切方法同上。PCR驗證，體系程序與從水稻基因組擴(kuò)目標(biāo)基因相同。挑陽性克隆，把構(gòu)建好的載體電轉(zhuǎn)農(nóng)桿菌EHA105，抽質(zhì)粒，PCR驗證，取750ul含構(gòu)建好載體的農(nóng)桿菌菌液加等體積的50％甘油混勻，-70℃保存。構(gòu)建好的載體命名為pU17310。2.遺傳轉(zhuǎn)化采用農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法(Hiei等，Efficienttransformationofrice(OryzasativaL.)mediatedbyAgrobacteriumandsequenceanalysisoftheboundariesoftheT-DNA，1994，PlantJournal6271-282)將超表達(dá)載體導(dǎo)入正常中花11水稻品種。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化步驟如下1)愈傷誘導(dǎo)(1)將成熟的水稻種子去殼，然后依次用70％的乙醇處理1分鐘，0.15％氯化汞(HgCl2)15分鐘；(2)滅菌水洗種子4-5次；(3)將種子放在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；(4)置于黑暗處培養(yǎng)5周，溫度25-27℃。2)愈傷繼代挑選亮黃色、緊實且相對干燥的胚性愈傷，放于繼代培養(yǎng)基上黑暗下培養(yǎng)2周，溫度25-27℃。3)預(yù)培養(yǎng)挑選緊實且相對干燥的胚性愈傷，放于預(yù)培養(yǎng)基上黑暗下培養(yǎng)4天，溫度25-27℃。4)農(nóng)桿菌培養(yǎng)(1)在帶有卡那霉素的LA培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)含構(gòu)建好載體的農(nóng)桿菌EHA105兩天，溫度28℃；(2)將農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)移至懸浮培養(yǎng)基里，28℃搖床上培養(yǎng)2-3小時。5)農(nóng)桿菌侵染(1)將預(yù)培養(yǎng)的愈傷轉(zhuǎn)移至滅菌好的瓶子內(nèi)；(2)調(diào)節(jié)農(nóng)桿菌的懸浮液至OD6000.8-1.0；(3)將愈傷在農(nóng)桿菌懸浮液中浸泡30分鐘；(4)轉(zhuǎn)移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；然后放置在共培養(yǎng)基上培養(yǎng)3天，溫度19-20℃。6)愈傷洗滌和選擇培養(yǎng)(1)滅菌水洗滌愈傷至看不見農(nóng)桿菌；(2)浸泡在含400ppm頭孢霉素的滅菌水中30分鐘；(3)轉(zhuǎn)移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；(4)轉(zhuǎn)移愈傷至選擇培養(yǎng)基上選擇2-3次，每次2周。(第一次頭孢霉素篩選濃度為400ppm，第二次以后為250ppm)7)分化(1)將抗性愈傷轉(zhuǎn)移至預(yù)分化培養(yǎng)基上黑暗處培養(yǎng)5-7天；(2)轉(zhuǎn)移預(yù)分化培養(yǎng)的愈傷至分化培養(yǎng)基上，光照(2000lx)下培養(yǎng)，溫度26℃，5-7周。8)生根(1)拔出分化好的苗子，剪掉分化時產(chǎn)生的根；(2)然后將其轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中光照下培養(yǎng)2-3周，溫度26℃。9)移栽洗掉根上的殘留培養(yǎng)基，將具有良好根系的幼苗轉(zhuǎn)入溫室，同時在最初的幾天保持水分濕潤。3.Osa-MIR156e基因超表達(dá)結(jié)果和應(yīng)用最后獲得超表達(dá)的組培苗100株，作為對照的由正常中花11愈傷分化的苗子30株，都種于大田，結(jié)果約有50％的超表達(dá)組培苗出現(xiàn)分蘗多，半矮，半不育的突變表型，見超表達(dá)實驗結(jié)果統(tǒng)計。說明Osa-MIR156e基因具有控制水稻分蘗的功能，同時還具有控制水稻株高和育性的功能。為解決人口增長與耕地面積減少的矛盾，提高水稻單位面積產(chǎn)量仍是人們面臨的挑戰(zhàn)。50、60年代的矮化育種和70年代的雜交水稻培育是水稻增產(chǎn)的兩次革命，但近幾年來水稻的增產(chǎn)開始徘徊。1994年國際水稻所(IRRI)提出水稻理想株型育種，就是基于控制水稻分蘗總數(shù)、提高成穗率、塑造穗大粒多一類新株型的指導(dǎo)思想。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法也可以是基因槍法或其它遺傳轉(zhuǎn)化方法超量表達(dá)控制水稻分蘗基因Osa-MIR156e在水稻中的表達(dá)量來提高水稻的分蘗數(shù)或著通過遺傳轉(zhuǎn)化方法抑制表達(dá)控制水稻分蘗基因Osa-MIR156e在水稻中的表達(dá)量來減少水稻分蘗數(shù)，達(dá)到控制水稻分蘗數(shù)的目的，形成理想株型。所以根據(jù)不同水稻品種的要求增加或減少水稻的分蘗數(shù)，形成理想的水稻株型，達(dá)到增產(chǎn)的目的?？刂扑痉痔Y基因Osa-MIR156e可以在轉(zhuǎn)基因水稻中應(yīng)用也可以在轉(zhuǎn)基因水稻種子中應(yīng)用，培育具有優(yōu)良水稻株型的品種。超表達(dá)實驗結(jié)果統(tǒng)計附農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化試劑和配方(1)試劑和溶液縮寫6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-芐基腺嘌呤)；KT(Kinetin，激動素)；NAA(Napthaleneaceticacid，萘乙酸)；IAA(Indole-3-aceticacid，吲哚乙酸)；2，4-D(2，4-Dichlorophenoxyaceticacid，2，4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH(CaseinEnzymaticHydrolysate，水解酪蛋白)；HN(HygromycinB，潮霉素)；DMSO(DimethylSulfoxide，二甲基亞砜)；N6max(N6大量成分溶液)；N6min(N6小量成分溶液)；MSmax(MS大量成分溶液)；MSmin(MS小量成分溶液)(2)組織培養(yǎng)的溶液配方1)N6max母液[10倍濃縮液(10X)]硝酸鉀(KNO3)28.3g磷酸二氫鉀(KH2PO4)4.0g硫酸銨((NH4)2SO4)4.63g硫酸鎂(MgSO4·7H2O)1.85g氯化鈣(CaCl2·2H2O)1.66g逐一溶解，然后在20-25℃下定容至1000ml。2)N6min母液[100倍濃縮液(100X)]碘化鉀(KI)0.08g硼酸(H3BO3)0.16g硫酸錳(MnSO4·4H2O)0.44g硫酸鋅(ZnSO4·7H2O)0.15g在20-25℃下溶解并定容至1000ml。3)Fe2EDTA貯存液(100X)在一個大三角瓶中加入300ml蒸餾水和硫酸鐵(FeSO4·7H2O)2.78g在另一個大三角瓶中加入300ml蒸餾水并加熱至70℃，然后加入乙二銨四乙酸二鈉(Na2EDTA·2H2O)3.73g在它們都溶解后混合在一起，70℃水浴中保持2小時，定容至1000ml，4℃保存?zhèn)溆谩?)維生素貯存液(100X)煙酸(Nicotinicacid)0.1g維生素B1(ThiamineHCl)0.1g維生素B6(PyridoxineHCl)0.1g甘氨酸(Glycine)0.2g肌醇(Inositol)10g加水定容至1000ml，4℃保存?zhèn)溆谩?)MSmax母液(10X)硝酸銨(NH4NO3)16.5g硝酸鉀19.0g磷酸二氫鉀1.7g硫酸鎂3.7g氯化鈣4.4g在20-25℃下溶解并定容至1000ml。6)MSmin母液(100X)碘化鉀0.083g硼酸0.62g硫酸錳(MnSO4·4H2O)2.23g硫酸鋅(ZnSO4·7H2O)0.86g鉬酸鈉(Na2MoO4·2H2O)0.025g硫酸銅(CuSO4·5H2O)0.0025g氯化鈷(CoCl2·6H2O)0.0025g在20-25℃下溶解并定容至1000ml。7)2，4-D貯存液(1mg/ml)2，4-D100mg.1ml1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10ml蒸餾水溶解完全后定容至100ml，在20-25℃下保存。8)6-BA貯存液(1mg/ml)6-BA100mg.1ml1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10ml蒸餾水溶解完全后定容至100ml，在20-25℃下保存。9)NAA貯存液(1mg/ml)NAA100mg.1ml1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10ml蒸餾水溶解完全后定容至100ml，4℃保存?zhèn)溆谩?0)IAA貯存液(1mg/ml)IAA100mg.1ml1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10ml蒸餾水溶解完全后定容至100ml，4℃保存?zhèn)溆谩?1)葡萄糖貯存液(0.5g/ml)葡萄糖125g蒸餾水溶解定容至250ml，滅菌后4℃保存?zhèn)溆谩?2)AS貯存液AS0.392gDMSO10ml分裝至1.5ml離心管內(nèi)，4℃保存?zhèn)溆谩?3)1N氫氧化鉀貯存液氫氧化鉀5.6g蒸餾水溶解定容至100ml，在20-25℃下保存?zhèn)溆谩?4)KT貯存液(1mg/ml)KT100mg.1ml1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10ml蒸餾水溶解完全后定容至100ml，在20-25℃下保存。(3)培養(yǎng)基配方1)誘導(dǎo)培養(yǎng)基N6max母液(10X)100mlN6mix母液(100X)10mlFe2+EDTA貯存液(100X)10ml維生素貯存液(100X)10ml2，4-D貯存液2.5ml脯氨酸(Proline)0.3gCH0.6g蔗糖(Sucrose)30gPhytagel3g加蒸餾水至900ml，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.9，煮沸(100℃)并定容至1000ml，分裝到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口滅菌。2)繼代培養(yǎng)基N6max母液(10X)100mlN6mix母液(100X)10mlFe2+EDTA貯存液(100X)10ml維生素貯存液(100X)10ml2，4-D貯存液2.0ml脯氨酸0.5gCH0.6g蔗糖30gPhytagel3g加蒸餾水至900ml，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.9，煮沸(100℃)并定容至1000ml，分裝到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口滅菌。3)預(yù)培養(yǎng)基N6max母液(10X)12.5mlN6mix母液(100X)1.25mlFe2+EDTA貯存液(100X)2.5ml維生素貯存液(100X)2.5ml2，4-D貯存液0.75mlCH0.15g蔗糖5g瓊脂粉(Agarose)1.75g加蒸餾水至250ml，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.6，封口滅菌。使用前加熱溶解培養(yǎng)基并加入5ml葡萄糖貯存液和250μlAS貯存液，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/皿)。4)共培養(yǎng)基N6max母液(10X)12.5mlN6mix母液(100X)1.25mlFe2+EDTA貯存液(100X)2.5ml維生素貯存液(100X)2.5ml2，4-D貯存液0.75mlCH0.2g蔗糖5g瓊脂粉1.75g加蒸餾水至250ml，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.6，封口滅菌。使用前加熱溶解培養(yǎng)基并加入5ml葡萄糖貯存液和250μlAS貯存液，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/皿)。5)懸浮培養(yǎng)基N6max母液(10X)5mlN6mix母液(100X)0.5mlFe2+EDTA貯存液(100X)0.5ml維生素貯存液(100X)1ml2，4-D貯存液0.2mlCH0.08g蔗糖2g加蒸餾水至100ml，調(diào)節(jié)pH值到5.4，分裝到兩個100ml的三角瓶中，封口滅菌。使用前加入1ml葡萄糖貯存液和100μlAS貯存液。6)選擇培養(yǎng)基N6max母液(10X)25mlN6mix母液(100X)2.5mlFe2+EDTA貯存液(100X)2.5ml維生素貯存液(100X)2.5ml2，4-D貯存液0.625mlCH0.15g蔗糖7.5g瓊脂粉1.75g加蒸餾水至250ml，調(diào)節(jié)pH值到6.0，封口滅菌。使用前溶解培養(yǎng)基，加入250μl50mg/ml的潮霉素和400ppm頭孢霉素，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/皿)。7)預(yù)分化培養(yǎng)基N6max母液(10X)25mlN6mix母液(100X)2.5mlFe2+EDTA貯存液(100X)2.5ml維生素貯存液(100X)2.5ml6-BA貯存液0.5mlKT貯存液0.5mlNAA貯存液50μlIAA貯存液50μlCH0.15g蔗糖7.5g瓊脂粉1.75g加蒸餾水至250ml，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.9，封口滅菌。使用前溶解培養(yǎng)基，加入250μl50mg/ml的潮霉素和400ppm頭孢霉素，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/皿)。8)分化培養(yǎng)基N6max母液(10X)100mlN6mix母液(100X)10mlFe2+EDTA貯存液(100X)10ml維生素貯存液(100X)10ml6-BA貯存液2mlKT貯存液2mlNAA貯存液0.2mlIAA貯存液0.2mlCH1g蔗糖30gPhytagel3g加蒸餾水至900ml，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到6.0。煮沸(100℃)并定容至1000ml，分裝到100ml三角瓶(50ml/瓶)，封口滅菌。9)生根培養(yǎng)基MSmax母液(10X)50mlMSmix母液(100X)5mlFe2+EDTA貯存液(100X)5ml維生素貯存液(100X)5ml蔗糖20gPhytagel3g加蒸餾水至900ml，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.8。煮沸(100℃)并定容至1000ml，分裝到生根管中(25ml/管)，封口滅菌。10)LA培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基不含瓊脂粉)蛋白胨2.5g酵母粉1.25g氯化鈉2.5g瓊脂粉3.2g蒸餾水溶解定容至250ml，裝于500ml三角瓶，滅菌后20-25℃保存?zhèn)溆谩Ｐ蛄斜?amp;lt;110>華中農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>控制水稻分蘗的基因及用途<130>控制水稻分蘗的基因及用途<160>1<170>PatentInversion3.1<210>1<211>390<212>DNA<213>Oryzasativaatggcggtgtctccggccggcgggcgagcgggccggtggcgcgaggtgacagaagagagt60gagcacacggccgggcgtgacggcaccggcgggcgtgccgtcgcggccgcgtgctcactg120ctctttctgtcatccggtgccggccgttttctccccctcccgcggctagctaagctggcc180tctcggcccctcgccggccggccggtcgccgacggaatcccctgtactgctccgcgcgcc240atgagctgttccgagtctctaggctctttagattaattcgatcccctcttctccggcgca300atcgtgcataggcgcagttgccaggttctagatctctcacaatcgaattgatgcattctg360cgatttttcgttcgtgttccagcgccgtga390權(quán)利要求1.一種控制水稻分蘗基因Osa-MIR156e，它具有SEQ.ID.No.1所示的核苷酸序列。2.權(quán)利要求1所述的一種控制水稻分蘗基因Osa-MIR156e在轉(zhuǎn)基因水稻中的應(yīng)用。3.權(quán)利要求1所述的一種控制水稻分蘗基因Osa-MIR156e在轉(zhuǎn)基因水稻種子中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域。具體涉及一種控制水稻分蘗基因Osa－MIR156e的分離克隆及應(yīng)用。Osa－MIR156e基因在水稻基因組中有多個同源基因，與擬南芥ath－MIR156基因?qū)儆谕换蚣易錗IR156。Osa－MIR156e基因具有控制水稻分蘗的功能，通過基因工程技術(shù)提高或減弱Osa－MIR156e基因的表達(dá)量能夠控制植物分蘗或分枝的數(shù)量，從而形成理想株型，達(dá)到增產(chǎn)的目的。文檔編號C12N15/82GK101037694SQ20061001854公開日2007年9月19日申請日期2006年3月15日優(yōu)先權(quán)日2006年3月15日發(fā)明者張啟發(fā),陳志輝,吳昌銀申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)