一種吉他霉素工業(yè)化生產(chǎn)菌種的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物發(fā)酵的菌種制備及培養(yǎng)方法，具體涉及一種吉他霉素工業(yè)化生產(chǎn) 菌種的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 吉他霉素屬大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，是一種抗菌藥，對(duì)革蘭氏陽性細(xì)菌和陰性細(xì)菌、立 克次氏體、螺旋體和大型病毒有較強(qiáng)的抑菌作用，并且對(duì)部份大環(huán)內(nèi)酯類耐藥菌也有效;抗 菌譜雖與紅霉素相似，但不產(chǎn)生誘導(dǎo)耐藥，細(xì)菌形成耐藥較慢，是一種較好的抗生素替代品 種，廣泛應(yīng)用于抗青霉素的葡萄球菌、鏈球菌、肺炎鏈球菌感染，同時(shí)，在歐美和日本等國(guó)吉 他霉素也常作為飼料添加劑使用，也是我國(guó)農(nóng)業(yè)部《飼料藥物添加劑使用規(guī)范》I類藥物中 明確規(guī)定可以使用的一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。目前，吉他霉素種子的制備工藝普遍采用新 鮮斜面孢子接種子搖瓶培養(yǎng)再進(jìn)種子罐培養(yǎng)，由于新鮮斜面孢子在保藏過程中，孢子活力 會(huì)發(fā)生變化，受保藏時(shí)間限制，一次不可能制備太多斜面?zhèn)溆茫@種工藝制備的種子生長(zhǎng)周 期不穩(wěn)定，批次更換頻繁，造成了吉他霉素發(fā)酵水平的不穩(wěn)定。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是提供一種吉他霉素工業(yè)化生產(chǎn)菌種的制備方法。
[0004] 基于上述目的，本發(fā)明采取如下技術(shù)方案： 一種吉他霉素工業(yè)化生產(chǎn)菌種的制備方法，包括如下步驟： a) 單菌落制備:將吉他霉素菌種加入0.5-1.OmL無菌生理鹽水，震蕩均勻，制成菌懸液， 接種針蘸取，在分離平板上劃線，在26-30°C平板培養(yǎng)6-12天，得到單菌落； b) 斜面孢子制備:取步驟a)制備的單菌落均勻涂布到斜面上，在26-30°C斜面培養(yǎng)6-12 天； c) 凍干菌種管制備:在無菌條件下用接種環(huán)將斜面孢子刮下，用冷凍真空干燥法制成 凍干菌種管，在4°C保藏； d) 牛奶冷凍管制備:將步驟c)制備凍干菌種管開封，加入0.5-1.OmL無菌生理鹽水，震 蕩均勻，制成菌懸液，接種環(huán)蘸取均勻涂布到斜面上，在26-30°C斜面培養(yǎng)6-12天，在無菌條 件下用接種環(huán)將斜面孢子刮下，加入l〇_25wt%的脫脂牛奶水溶液2mL，分裝0.2mL到容量為 2.OmL的菌種保藏管中得到孢子牛奶冷凍管，在-20°C~-80°C保藏； e) 進(jìn)罐種子制備:取步驟d)制備的孢子牛奶冷凍管接入種子搖瓶培養(yǎng)基中，置于26-30 〇C的 搖床上培養(yǎng)24-48h，料液外觀呈棕褐色，鏡檢菌絲粗壯，染色深，網(wǎng)狀，即可進(jìn)入種子罐 培養(yǎng)。
[0005] 進(jìn)一步地，步驟a)中平板培養(yǎng)所用培養(yǎng)基的配方為:可溶性淀粉1.0-2.Owt%，酵母 浸膏0 · 1-0 · 8wt%，硫酸鎂0 · 025-0 · 075wt%，磷酸二氫鉀0 · 025-0 · 075wt%，瓊脂粉 1 · 5-2.5wt%，余量為水。
[0006] 步驟b)和步驟d)中斜面培養(yǎng)所用培養(yǎng)基的配方為：可溶性淀粉1.0-2.Owt%，酵母 浸膏0 · 1-0 · 8wt%，硫酸鎂0 · 025-0 · 075wt%，磷酸二氫鉀0 · 025-0 · 075wt%，瓊脂粉 1 · 5-2.5wt%，余量為水。
[0007] 步驟e)所述種子搖瓶培養(yǎng)基的配方為:淀粉1.5-2.5wt%，黃豆餅粉1.0-2.Owt%，氯 化鈉0 · 2-1 ·Owt%，葡萄糖0 · 5-2 · 5wt%，蛋白胨0 · 25-1 ·Owt%，酵母粉0 · 1-0 · 6wt%，硫酸銨0 · 1-1 ·Owt%，硫酸鎂0 · 01-0 · 05wt%，磷酸二氫鉀0 · 01-0 · 05wt%，余量為水，滅菌前20wt%氫氧化鈉 溶液調(diào)pH至6.8-7.5，120°C滅菌30min，加入占該培養(yǎng)基質(zhì)量0.2-0.8%的碳酸鈣，攪勻、分 裝，每500mL三角瓶中裝50mL培養(yǎng)基。
[0008] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所述方法制備的吉他霉素工業(yè)化生產(chǎn)菌種搖瓶種子生長(zhǎng) 周期在24小時(shí)左右，解決了采用傳統(tǒng)菌種制備方法制得菌種在種子瓶生長(zhǎng)周期時(shí)長(zhǎng)時(shí)短、 不固定的問題。因?yàn)樵谏a(chǎn)過程中，各工序基本是按照固定時(shí)間進(jìn)行工作，如果種子生長(zhǎng)周 期不固定，就會(huì)影響發(fā)酵罐周期及后面工序的運(yùn)行，給生產(chǎn)帶來不便。如果菌種批次變動(dòng)太 頻繁，每批次種子間差異或同一批次前后不均一，會(huì)造成生產(chǎn)波動(dòng)。本發(fā)明技術(shù)方案首先通 過單菌落的挑選過程使種子得到純化;進(jìn)一步通過斜面的培養(yǎng)過程，使種子的生長(zhǎng)得到同 步化;經(jīng)過制作成牛奶冷凍管保藏，避免新鮮斜面保存時(shí)間段，同一批次前后不均一情況發(fā) 生。
【具體實(shí)施方式】
[0009] 本發(fā)明實(shí)施例使用的吉他霉素菌種為吉他鏈霉菌甘露糖變種，為四川抗菌素研究 所提供的吉他霉素生產(chǎn)菌。
[0010] 實(shí)施例1 一種吉他霉素工業(yè)化生產(chǎn)菌種的制備方法，包括如下步驟： a) 單菌落制備:將初始吉他霉素菌種管開封，加入0.5mL無菌生理鹽水，震蕩均勻，制 成菌懸液，接種針蘸取，在分離平板上劃線，置于28°C恒溫室中平板培養(yǎng)9天，得到單菌落； b) 斜面孢子制備:取步驟a)制備的單菌落均勻涂布到斜面上，28°C恒溫室中斜面培養(yǎng) 9天； c) 凍干菌種管制備:取步驟b)制備的斜面孢子，在無菌條件下用接種環(huán)將斜面孢子刮 下，用冷凍真空干燥法制備凍干菌種管，貼上標(biāo)簽，寫好日期、批號(hào)，置于4°C冰箱中保藏； d) 牛奶冷凍管制備:將步驟c)制備凍干菌種管開封，加入0.5mL無菌生理鹽水，震蕩均 勻，制成菌懸液，接種環(huán)蘸取均勻涂布到斜面上，28°C恒溫室中斜面培養(yǎng)9天，在無菌條件 下用接種環(huán)將斜面孢子刮下，加入20wt%的脫脂牛奶水溶液2mL，分裝0.2mL到容量為2.OmL 的菌種保藏管中得到孢子牛奶冷凍管，貼上標(biāo)簽，寫好日期，批號(hào)，置于_80°C低溫冰箱中保 藏； e) 進(jìn)罐種子制備:取步驟d)制備的孢子牛奶冷凍管接入種子搖瓶培養(yǎng)基中，置于28°C、 振幅25mm、轉(zhuǎn)速230rpm的搖床上培養(yǎng)32h，料液外觀呈棕褐色，鏡檢菌絲粗壯，染色深，網(wǎng)狀， 即可進(jìn)入種子罐培養(yǎng)。
[0011] 進(jìn)一步地，步驟a)中平板培養(yǎng)所用培養(yǎng)基的配方為:可溶性淀粉1.5wt%，酵母浸膏 0.4wt%，硫酸鎂0.05wt%，磷酸二氫鉀0.05wt%，瓊脂粉1.8wt%，余量為水;裝液量:容量500mL三角瓶裝100mL培養(yǎng)基，滅菌前20wt%氫氧化鈉水溶液調(diào)pH至7.4，120°C滅菌30min，滅菌后 置無菌室，待培養(yǎng)基溫度降至50.0°C時(shí)，在潔凈工作臺(tái)上倒入空消好的雙碟內(nèi)，每碟倒入培 養(yǎng)基30mL，使均勻分布，凝固。
[0012]步驟b)和步驟d)所述斜面培養(yǎng)所用培養(yǎng)基的配方為:可溶性淀粉1.5wt%，酵母浸 膏0.4wt%，硫酸鎂0.05wt%，磷酸二氫鉀0.05wt%，瓊脂粉1.8wt%，余量為水；裝液量：容量 500mL三角瓶裝100mL培養(yǎng)基，20wt%氫氧化鈉水溶液調(diào)pH至7.4，120°C滅菌30min，滅菌后置 無菌室，待培養(yǎng)基溫度降至50.0°C時(shí)，在潔凈工作臺(tái)上倒入空消好的雙碟內(nèi)，每碟倒入培養(yǎng) 基30mL，使均勻分布，凝固。
[0013]步驟e)所述種子搖瓶培養(yǎng)所用培養(yǎng)基的配方為:淀粉2.Owt%，黃豆餅粉1.8wt%，氯 化鈉0.5wt%，葡萄糖0.8wt%，蛋白胨0.3wt%，酵母粉0.5wt%，硫酸銨0.4wt%，硫酸鎂0.03wt%， 磷酸二氫鉀〇.〇3?^%，碳酸媽0.6?^%，余量為水，滅菌前20?^%氫氧化鈉水溶液調(diào)？!1至7.4， 120°C滅菌30min，加入占該培養(yǎng)基質(zhì)量0.5%的Ca⑶3，攪勻、分裝，每500mL三角瓶中裝50mL 培養(yǎng)基。
[0014] 按傳統(tǒng)菌種制備方式:取用冷凍真空干燥法制備凍干菌種管開封，不經(jīng)過單菌落 制備，直接制作斜面孢子保藏備用。按照傳統(tǒng)方式制備的菌種和實(shí)施例制得的菌種經(jīng)過不 同時(shí)間保藏，考察達(dá)到工藝要求的種子生長(zhǎng)周期見表1。
[0015] 表1不同制備方法制備的種子對(duì)種子生長(zhǎng)周期的影響
從上表中可以看出，使用本發(fā)明制備的菌種接種后，達(dá)到目標(biāo)值種子生長(zhǎng)周期穩(wěn)定，經(jīng) 長(zhǎng)時(shí)間保藏，沒有發(fā)生變化，而傳統(tǒng)菌種制備的斜面菌種在使用過程中要延長(zhǎng)種子培養(yǎng)周 期，且超過25天以后，就不能使用，必須更換批次。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種吉他霉素工業(yè)化生產(chǎn)菌種的制備方法，其特征在于，包括如下步驟： a) 單菌落制備:將吉他霉素菌種加入0.5-1.OmL無菌生理鹽水，震蕩均勻，制成菌懸液， 接種針蘸取，在分離平板上劃線，在26-30°C平板培養(yǎng)6-12天，得到單菌落； b) 斜面孢子制備:取步驟a)制備的單菌落均勻涂布到斜面上，在26-30°C斜面培養(yǎng)6-12 天； c) 凍干菌種管制備:在無菌條件下用接種環(huán)將斜面孢子刮下，用冷凍真空干燥法制成 凍干菌種管，在4°C保藏； d) 牛奶冷凍管制備:將步驟c)制備凍干菌種管開封，加入0.5-1.OmL無菌生理鹽水，震 蕩均勻，制成菌懸液，接種環(huán)蘸取均勻涂布到斜面上，在26-30°C斜面培養(yǎng)6-12天，在無菌條 件下用接種環(huán)將斜面孢子刮下，加入l〇_25wt%的脫脂牛奶水溶液2mL，分裝0.2mL到容量為 2.OmL的菌種保藏管中得到孢子牛奶冷凍管，在-20°C~-80°C保藏； e) 進(jìn)罐種子制備:取步驟d)制備的孢子牛奶冷凍管接入種子搖瓶培養(yǎng)基中，置于26-30 〇C的 搖床上培養(yǎng)24-48h，料液外觀呈棕褐色，鏡檢菌絲粗壯，染色深，網(wǎng)狀，即可進(jìn)入種子罐 培養(yǎng)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的吉他霉素工業(yè)化生產(chǎn)菌種的制備方法，其特征在于，步驟a)中 平板培養(yǎng)所用培養(yǎng)基的配方為：可溶性淀粉1.0-2.Owt%，酵母浸膏0.1-0.8wt%，硫酸鎂 0 · 025-0 · 075wt%，磷酸二氫鉀 0 · 025-0 · 075wt%，瓊脂粉 1 · 5-2 · 5wt%，余量為水。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的吉他霉素工業(yè)化生產(chǎn)菌種的制備方法，其特征在于，步驟b)和 步驟d)中斜面培養(yǎng)所用培養(yǎng)基的配方為:可溶性淀粉1.0-2.Owt%，酵母浸膏0.1-0.8wt%，硫 酸鎂 0 · 025-0 · 075wt%，磷酸二氫鉀0 · 025-0 · 075wt%，瓊脂粉 1 · 5-2 · 5wt%，余量為水。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的吉他霉素工業(yè)化生產(chǎn)菌種的制備方法，其特征在于，步驟e)所 述種子搖瓶培養(yǎng)基的配方為：淀粉1.5-2.5wt%，黃豆餅粉1.0-2.Owt%，氯化鈉0.2-1.Owt%， 葡萄糖0.5-2.5wt%，蛋白胨0.25-1 .Owt%，酵母粉0.1-0.6wt%，硫酸銨0.1-1 .Owt%，硫酸鎂 0 · 01-0 · 05wt%，磷酸二氫鉀 0 · 01-0 · 05wt%，余量為水。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種吉他霉素工業(yè)化生產(chǎn)菌種的制備方法，該方法主要步驟為將原始菌種平板劃線制備單菌落，將單菌落傳接斜面上，培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間，然后用接種環(huán)將斜面孢子刮下用冷凍真空干燥法制備凍干菌種管；取此凍干菌種管，制成孢子懸液，涂布斜面上，培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間，然后用接種環(huán)將斜面孢子刮下，制成孢子牛奶懸液進(jìn)行分裝后冷凍保藏制備孢子牛奶冷凍管。取孢子牛奶冷凍管融化后接入種子培養(yǎng)基中，搖瓶震蕩培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間，然后接入種子罐。該方法克服了生產(chǎn)斜面菌種接種生產(chǎn)同步性差，種子瓶生長(zhǎng)周期長(zhǎng)短不一，批次更換頻繁等缺點(diǎn)。本發(fā)明的制備方法操作簡(jiǎn)便，提高了菌種的種齡和種子質(zhì)量的一致性，減少種子更換批次，非常適合吉他霉素工業(yè)化生產(chǎn)。
【IPC分類】C12N1/04, C12R1/465, C12N1/20
【公開號(hào)】CN105420148
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510886364
【發(fā)明人】劉守強(qiáng), 呂和平, 劉麗杰, 劉果, 陳忠剛, 陳金春, 王留國(guó), 王雪潔, 謝書勤, 張欽林, 李愛玲, 張紅輝, 王海霞, 龐云靜, 馬珍珍
【申請(qǐng)人】天方藥業(yè)有限公司
【公開日】2016年3月23日
【申請(qǐng)日】2015年12月7日