一種豬流行腹瀉蛋白重組質(zhì)粒及其制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種豬流行腹瀉蛋白重組質(zhì)粒及其制備方法 與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒 (Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)引起的病毒性高度傳染性腸道疾病，以豬嘔 吐，嚴(yán)重腹瀉脫水為主要臨床癥狀特征。主要發(fā)生于7日齡內(nèi)哺乳仔豬感染時(shí)發(fā)病最為多 見(jiàn)，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致全群發(fā)病，只是哺乳仔豬嚴(yán)重死亡，保育豬和育肥豬增重減慢，對(duì)養(yǎng)豬業(yè) 造成很大損失。
[0003] PEDV屬于尼多病毒目冠狀病毒科冠狀病毒屬，其基因組為不分節(jié)段的單股正鏈 RNA，基因組全長(zhǎng)約28033bp，編碼的結(jié)構(gòu)蛋白主要有纖突（spike)蛋白（即S蛋白），囊膜 (Membrane)蛋白（即M蛋白），核衣殼（nucleocapsid)蛋白（即N蛋白）。PEDV S蛋白可 以被劃分為2個(gè)功能去即Sl (第1-789位氨基酸和S2 (第790-1383位氨基酸），其中Sl區(qū) 包含了病毒主要的中和表位和受體結(jié)合域。
[0004] 核酸疫苗是把外源基因克隆到真核質(zhì)粒表達(dá)載體上，然后將重組的質(zhì)粒DNA直接 注射到動(dòng)物體內(nèi)，使外源基因在活體內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生的抗原激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，引發(fā)免疫反 應(yīng)。核酸疫苗與其他疫苗相比，具有無(wú)可比擬的優(yōu)點(diǎn)：如生產(chǎn)成本低，易于構(gòu)建適于大批量 生產(chǎn)，可以根據(jù)需要隨時(shí)進(jìn)行更新，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，保存和運(yùn)輸方便，不存在減毒疫苗毒力 回升的危險(xiǎn)；選擇抗原決定簇的自由空間比較大，可以同時(shí)構(gòu)建編碼不同蛋白質(zhì)的重組質(zhì) 粒同時(shí)預(yù)防多種疾病，為制備聯(lián)合疫苗方面提供了廣闊空間。
[0005] 核酸疫苗是在細(xì)胞水平上轉(zhuǎn)移外源抗原基因，同時(shí)轉(zhuǎn)移并表達(dá)多個(gè)外源基因在基 因治療領(lǐng)域有重要的應(yīng)用價(jià)值。主要采取兩種途徑：一是多個(gè)攜帶不同基因的獨(dú)立載體系 統(tǒng)同時(shí)轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞，優(yōu)點(diǎn)是可以自由調(diào)節(jié)各表達(dá)載體的比例，缺點(diǎn)是效率太低。二是在同一 個(gè)載體上構(gòu)建、表達(dá)多個(gè)基因。這種方式可以提高轉(zhuǎn)移及表達(dá)效率，同時(shí)在使用的過(guò)程中一 個(gè)質(zhì)粒有多個(gè)基因，簡(jiǎn)單方便。
[0006] 使用內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（Internal Ribosome Entrysite, IRES)連接多個(gè)基因 是近年來(lái)多基因表達(dá)的重要方法，IRES序列來(lái)源于某些病毒和細(xì)胞的mRNA5'端的一段非 翻譯區(qū)。在上游啟動(dòng)子的控制下，該序列及與之相連的基因可同時(shí)轉(zhuǎn)錄，并以不依賴帽的方 式啟動(dòng)遠(yuǎn)端mRNA的翻譯，從而在同一轉(zhuǎn)錄本上翻譯出不同的蛋白。采用IRES元件代替內(nèi) 部啟動(dòng)子克服了啟動(dòng)子間的抑制現(xiàn)象，尤其是當(dāng)目的基因與其后的選擇標(biāo)記基因共同翻譯 時(shí)，是近幾年來(lái)較為常用的連接方式。但I(xiàn)RES基因也存在上、下游基因表達(dá)不平衡的缺點(diǎn)。 IRES2在IRES的基因上進(jìn)行改良，效果更優(yōu)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種豬流行腹瀉蛋白重組質(zhì) 粒。
[0008] 為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：
[0009] -種豬流行性腹瀉蛋白重組質(zhì)粒，用于表達(dá)豬流行性腹瀉病毒中Sl蛋白、N蛋白 和M蛋白，所述重組質(zhì)粒攜帶有：
[0010] 載體質(zhì)粒；和
[0011] 依次連接的豬流行性腹瀉病毒Sl蛋白編碼基因、N蛋白編碼基因和M蛋白編碼基 因。
[0012] 作為優(yōu)選，所述Sl蛋白編碼基因與N蛋白編碼基因通過(guò)IRES2肽連接，所述N蛋 白編碼基因與M蛋白編碼基因通過(guò)IRES2肽連接。
[0013] 作為優(yōu)選，所述載體質(zhì)粒為pVAXl載體質(zhì)粒。
[0014] 作為優(yōu)選，該重組質(zhì)粒為pVAXl-Sl-IRES2-N-IRES2-M，其中pVAXl表示pVAXl載體 質(zhì)粒，Sl表示Sl蛋白編碼基因，N表示N蛋白編碼基因，M表示M蛋白編碼基因，IRES2表 示IRES2肽。
[0015] 本發(fā)明的另一目的在于提供上述的豬流行性腹瀉蛋白重組質(zhì)粒的制備方法，包括 以下步驟：
[0016] 1)構(gòu)建含有第一酶切位點(diǎn)-連接肽-N蛋白編碼基因-連接肽-M蛋白編碼基 因-第二酶切位點(diǎn)序列的原核重組質(zhì)粒；
[0017] 2)構(gòu)建含有第三酶切位點(diǎn)-Sl蛋白編碼基因-第一酶內(nèi)切酶切位點(diǎn)序列的真核重 組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化感受態(tài)，篩選第一陽(yáng)性克?。?br>[0018] 3)將真核載體質(zhì)粒與步驟1)構(gòu)建的原核重組質(zhì)粒雙酶切，進(jìn)行連接反應(yīng)，得到含 有真核載體質(zhì)粒-連接肽-N蛋白編碼基因-連接肽-M蛋白編碼基因-第二酶切位點(diǎn)序列 的真核重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化感受態(tài)，篩選第二陽(yáng)性克??；
[0019] 其中，所述真核載體質(zhì)粒的一端含有第三酶切位點(diǎn)，另一端含有第二酶切位點(diǎn)；
[0020] 4)將步驟2)第一陽(yáng)性克隆和步驟3)得到的第二陽(yáng)性克隆雙酶切，進(jìn)行連接反應(yīng)， 得到含有真核載體質(zhì)粒-Sl蛋白編碼基因-連接肽-N蛋白編碼基因-連接肽-M蛋白編碼 基因序列的重組質(zhì)粒。
[0021] 作為優(yōu)選，所述連接肽為IRES2肽。
[0022] 作為優(yōu)選，所述第一酶切位點(diǎn)為NotI酶切位點(diǎn)，所述第二酶切位點(diǎn)為Xhol酶切位 點(diǎn)，所述第三酶切位點(diǎn)為BamHI酶切位點(diǎn)。
[0023] 作為優(yōu)選，步驟2)中，構(gòu)建含有第三酶切位點(diǎn)-Sl蛋白編碼基因-第一酶內(nèi)切酶 切位點(diǎn)序列的真核重組質(zhì)粒的方法包括以下步驟：
[0024] 1)以PEDV-Sl的核酸序列為模板，以SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2為引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，得到Sl基因片段：
[0025] SEQ ID No. I ：CGCGGATCCATGAGGTCTTTAATTTAC ；
[0026] SEQ ID No. 2 ：ATAAGAATGCGGCCGCAATACTCATACTAAAGTT ；
[0027] 2)將擴(kuò)增得到的SI基因片段與真核載體質(zhì)粒連接，得到真核重組質(zhì)粒；
[0028] 所述真核載體質(zhì)粒為pMD18-T。
[0029] 作為優(yōu)選，其制備方法包括以下步驟：
[0030] 1)構(gòu)建 pUC57-NotI-IRES2-N-IRES2-M-Xhol 原核重組質(zhì)粒：
[0031] 2)構(gòu)建pMD18-T-Sl，轉(zhuǎn)化感受態(tài)，篩選第一陽(yáng)性克?。?br>[0032] a)以PEDV-Sl的核酸序列為模板，以SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2為引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，得到Sl基因片段：
[0033] SEQ ID No. I ：CGCGGATCCATGAGGTCTTTAATTTAC ；
[0034] SEQ ID No. 2 ：ATAAGAATGCGGCCGCAATACTCATACTAAAGTT ；
[0035] 將擴(kuò)增得到的SI基因片段與pMD18-T-Simple載體質(zhì)粒連接，得到pMD18-T-Sl質(zhì) 粒；
[0036] b)TA 克隆
[0037] 將步驟a)獲得的特異性的Sl片段與pMD18-T simple載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 DH5 α，涂布于含有卡那青霉素的瓊脂湯培養(yǎng)基上培養(yǎng)過(guò)夜，挑選單菌落于含有卡那青霉素 的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)過(guò)夜，小提質(zhì)粒，并進(jìn)行BamHI/Notl雙酶切鑒定，將pMD18-T-Sl陽(yáng)性克 隆進(jìn)彳丁測(cè)序鑒定；
[0038] 3)構(gòu)建 NotI-IRES2-N-IRES2-M-Xhol 真核重組質(zhì)粒；
[0039] 將 pVAXl 質(zhì)粒和 pUC57-NotI-IRES2-N-IRES2-M-Xhol 質(zhì)粒，分別用 NotI/ Xhol雙酶切，兩者在T4DNA連接酶的作用下發(fā)生連接反應(yīng)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 α，涂布 于含有卡那青霉素抗性的瓊脂糖培養(yǎng)基上培養(yǎng)過(guò)夜，小提質(zhì)粒，進(jìn)行PCR鑒定，得到 pVAXl-NotI-IRES2-N-IRES2-M 陽(yáng)性克??；
[0040] 4)構(gòu)建 pVAXl-Sl-IRES2-N-IRES2-M 重組質(zhì)粒；
[0041] 將步驟2)得到的pMD18-T-Sl陽(yáng)性克隆與步驟3)得至Ij pVAXl-NotI-IRES2-N-IRES2-M質(zhì)粒陽(yáng)性克隆分別用BamHI/Notl雙酶切，兩者在T4DNA連接 酶的作用下發(fā)生連接反應(yīng)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 α，涂布于含有卡那青霉素抗性的瓊脂糖培養(yǎng) 基上培養(yǎng)過(guò)夜，小提質(zhì)粒，進(jìn)行PCR鑒定和BamHI/Notl雙酶切鑒定，得到陽(yáng)性克隆，并送測(cè) 序，證實(shí)PVAX1-S1-IRES2-N-IRES2-M質(zhì)粒構(gòu)建成功。
[0042] 本發(fā)明的目的之三在于提供上述豬流行性腹瀉蛋白重組質(zhì)粒在制備豬流行性腹 瀉核酸疫苗中的應(yīng)用。
[0043] 相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于：
[0044] 1、本發(fā)明提供的質(zhì)粒在真核細(xì)胞內(nèi)能夠很好