用于疫苗和診斷學(xué)的Dps融合蛋白的制作方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】
[0001] 本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2010年12月22日，申請(qǐng)?zhí)枮?01080060432. 1，發(fā)明名稱(chēng)為"用 于疫苗和診斷學(xué)的Dps融合蛋白"的申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明總體上涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，并且具體地涉及微生物學(xué)、免疫學(xué)、診斷學(xué)和疫苗， 并且更具體地涉及通過(guò)使用Dps融合蛋白診斷、治療和預(yù)防疾病。
【背景技術(shù)】
[0003] Dds 蛋白
[0004] 來(lái)自饑餓細(xì)胞的DNA結(jié)合蛋白（Dps)是在細(xì)菌和古細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)充分保守 蛋白的家族，但其不存在于動(dòng)物或人中。它們?cè)趹?yīng)激條件下負(fù)責(zé)保護(hù)細(xì)胞DNA免受自由 基的損害。Dps是由以2:3對(duì)稱(chēng)排列的12個(gè)相同的亞基組成的十二聚體納米顆粒。其 具有9nm的直徑，內(nèi)腔直徑為4. 5nm(Grant等人，自然結(jié)構(gòu)與分子生物學(xué)咖七31：1'11(31:· Bioh )5:294 - 303, 1998)。大腸桿菌（E. Coli)的Dps是Dps的原型，其于1992年首先被 Almiron等人發(fā)現(xiàn)（基因與發(fā)育（Genes Dev) 6:2646 - 2654, 1992)。當(dāng)細(xì)胞處于應(yīng)激或饑餓 條件下時(shí)，Dps的表達(dá)增加（Almiron等人，基因與發(fā)育（Genes Dev) 6:2646 - 2654, 1992)。
[0005] 每個(gè)Dps亞基的分子量為~20kDa并且折疊成在相對(duì)的端部處具 有游離的N-和C-末端的緊密的四螺旋束（Grant等人，自然結(jié)構(gòu)與分子生 物學(xué)（Nat Struct. Biol. )5:294 - 303, 1998 ;Roy 等人，分子生物學(xué)（J Mol Biol. )370:752-67, 2007 ;Haikarainen 和 Papageorgiou.細(xì)胞分子生命科學(xué)（Cell Mol Life Sci. )67:341-51, 2010)。四個(gè)螺旋通過(guò)三個(gè)具有可變長(zhǎng)度的環(huán)序列相互連 接在一起。在游離的N-末端中也可以形成短的螺旋。12個(gè)拷貝的Dps亞基依照2:3 的對(duì)稱(chēng)性組裝成9nm納米顆粒，游離的N-和C-末端序列都暴露在表面上（Grant等 人，自然結(jié)構(gòu)與分子生物學(xué)（Nat Struct. Biol. )5:294 - 303, 1998 ;Stillman等人， 分子微生物學(xué)（Mol Microbiol. )57:1101-12, 2005 ;Roy 等人，分子生物學(xué)（J Mol Biol. )370:752-67, 2007 ;Haikarainen 和 Papageorgiou.細(xì)胞分子生命科學(xué)（Cell Mol Life Sci. )67:341-51, 2010)。來(lái)自幾種細(xì)菌和古細(xì)菌的Dps的晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)被確定，包括 大腸桿菌（Grant等人，自然結(jié)構(gòu)與分子生物學(xué)（Nat Struct. Biol. )5:294 - 303, 1998)、 硫橫礦硫化葉菌（Sulfolobus solfataricus) (Gauss 等人，生物化學(xué)（Biochemist ry), 45:10815-10827, 2006)、恥垢分支桿菌（Mycobacterium smegmatis) (Roy 等人，分 子生物學(xué)（J Mol Biol. )370:752-67, 2007)、耐福射球菌（Deinococcus radiodurans) (Kim 等人，分子生物學(xué)（J. Mol. Biol), 361:105-114, 2006)、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis) (Stillman 等人，分子微生物學(xué)（Mol Microbiol. )57:1101-12, 2005)和無(wú)害 李斯特菌（Listeria innocua) (Ilari等人，自然結(jié)構(gòu)與分子生物學(xué)（似〖31：1'11(31:· Biol.). 7:38-43, 2000)。從這些結(jié)構(gòu)分析理解，Dps的游離N-和C-末端序列，尤其是這些 末端序列的遠(yuǎn)端處的氨基酸經(jīng)常在電子密度圖上觀察不到或僅部分被觀察到。因此，盡管 總的末端序列可能存在于表面上，但末端序列的遠(yuǎn)端可能延伸至Dps結(jié)構(gòu)的內(nèi)部中。這在 硫磺礦硫化葉菌Dps (SsDps)的情況中得到證明，其中在密度圖中觀察到的在遠(yuǎn)端處未被 觀察到的氨基酸前的少數(shù)C-末端氨基酸被發(fā)現(xiàn)指向納米顆粒結(jié)構(gòu)的內(nèi)部（Gauss等人，生 物化學(xué)（Biochemistry)，45:10815-10827, 2006)。
[0006] Dps通過(guò)鐵結(jié)合和DNA結(jié)合來(lái)保護(hù)DNA免受氧化應(yīng)激（Zhao等人，生物化學(xué) (J Biol Chem) 277:27689 - 27696, 2002 ;Haikarainen 和 Papageorgiou.細(xì)胞分子生命 科學(xué)（Cell Mol Life Sci. )67:341-51, 2010)。結(jié)合Fe2+離子防止通過(guò)芬頓反應(yīng)生成毒 性羥基自由基，這些羥基自由基會(huì)損害DNA。鐵結(jié)合由位于亞基之間的界面處的獨(dú)特的 雙-鐵金屬結(jié)合位點(diǎn)介導(dǎo)，所述亞基包含保守氨基酸：組氨酸（His)、天冬氨酸（Asp)和谷 氨酸（Glu)。DNA結(jié)合提供對(duì)DNA的物理保護(hù)。在Dps的許多成員中Dps的N-或C-末 端富含堿性氨基酸并通過(guò)離子相互作用參與到DNA結(jié)合中（Ceci等人，核酸研究（Acids Res. )32:5935-5944, 2004 ;Roy 等人分子生物學(xué)（J Mol Biol. )470:752-67, 2007)。
[0007] 盡管十二聚體納米顆粒結(jié)構(gòu)在所有Dps之間非常保守，但在細(xì)菌或古細(xì)菌的不 同家族之間Dps -級(jí)氨基酸序列變化非常大。例如，大腸桿菌的Dps (Swiss-Prot登記號(hào) P0ABT2)與來(lái)自嗜超高溫古細(xì)菌硫磺礦硫化葉菌（Swiss-Prot登記號(hào)P95855)、嗜極端細(xì) 菌耐福射奇球菌（Deinococcus radiodurans) (Swiss-Prot登記號(hào)Q9RS64)、無(wú)害李斯特菌 (Listeria innocua) (Swiss-Prot 登記號(hào) P80725)、幽門(mén)螺桿菌（Helicobacter pylori) (Swiss-Prot 登記號(hào) P43313)或鏈球菌性肺炎（Streptococcus pneumonia) (Swiss-Prot 登 記號(hào)B1S132)的Dps僅共有〈30%氨基酸序列同一性。考慮到已經(jīng)在檢查的幾乎所有細(xì)菌 中都發(fā)現(xiàn)了 Dps，顯然存在這些遺傳上多種多樣來(lái)源的Dps。另一方面，Dps氨基酸序列在 細(xì)菌家族內(nèi)非常保守。例如，在腸桿菌科的成員，諸如痢疾志賀菌（Shigella dysenteriae) (Swiss-Prot 登記號(hào) Q32I91)、鼠傷寒沙門(mén)氏菌（Salmonella typhimurium) (Swiss-Prot 登記號(hào)Q7CQV9)、大腸桿菌（Swiss-Prot登記號(hào)P0ABT2)和肺炎克雷白桿菌（Klebsiella pneumonia) (Swiss-Prot登記號(hào)Q84FI02)之間，Dps的氨基酸同源性為90%以上。
[0008] 病原菌的Dps也可能參與到它們的致病性中。因此，幽門(mén)螺桿菌的Dps也已知為 中性粒細(xì)胞激活蛋白（HP-NAP)，對(duì)中性粒細(xì)胞有趨化性，并且參與炎癥反應(yīng)（Teneberg等 人，生物化學(xué)（J Biol Chem. )272:19067 - 19071，1997)?？漳c彎曲桿菌的 Dps 與 HP-NAP 共享很高的同源性，已經(jīng)顯示與硫苷脂結(jié)合，并且可能參與引起軸突損害（Piao等人，神經(jīng) 科學(xué)（J Neurol Sci. )288:54-62, 2010)。
[0009] 疫遊
[0010] 疫苗是用于預(yù)防和治療感染性疾病、癌癥和其他疾病狀態(tài)的生物產(chǎn)品。在大多 數(shù)情況下，疫苗針對(duì)可能由細(xì)菌、病毒或其他微生物導(dǎo)致的感染性疾病而開(kāi)發(fā)?？乖且?苗的活性組分，并由微生物的整體或一部分制成。微生物的表面上的蛋白經(jīng)常是能夠針 對(duì)該微生物產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答的最重要的抗原。來(lái)自微生物的內(nèi)部蛋白也能夠誘導(dǎo)保 護(hù)性效應(yīng)，尤其是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞免疫。蛋白抗原可以從微生物直接分離，或在表達(dá)宿主中 作為重組蛋白產(chǎn)生。蛋白抗原誘導(dǎo)保護(hù)性免疫的關(guān)鍵部分經(jīng)常表現(xiàn)為蛋白序列中的氨基 酸或肽的短鏈。它們可以通過(guò)其功能諸如細(xì)胞結(jié)合、細(xì)胞融合和中和，通過(guò)沿全部蛋白序 列系統(tǒng)性測(cè)試單個(gè)肽和比較序列分析來(lái)鑒定。這樣的抗原肽，通常長(zhǎng)度小于100個(gè)氨基 酸，與復(fù)合蛋白抗原相比較好地被確定，并且還可以被化學(xué)合成。在微生物的不同血清型 和菌株之間這些肽抗原中經(jīng)常高度保守，因此能夠產(chǎn)生交叉保護(hù)效應(yīng)。因此，在鑒定這些 肽抗原和使用這些肽抗原來(lái)制備可能提供通用保護(hù)作用的疫苗方面做出了極大的努力。 這些努力特別地與已知經(jīng)歷頻繁的遺傳改變和/或由多種血清型組成的微生物相關(guān)，包 括流感病毒、人免疫缺陷病毒（HIV)和人乳頭瘤病毒（HPV)。高度保守的肽的實(shí)例包括， 但不限于，流感病毒的M2e (Neirynck等人，自然醫(yī)學(xué)（Nat. Med. )，5, 1157-1163, 1999)、 HPV的L2蛋白肽（aal7_36和aal08_120) (Karanam等人，免疫細(xì)胞生物學(xué)（Immunol. Cell Bio. )87:287-299, 2009)、人免疫缺陷病毒（HIV)的gp41肽（Shi等人，生物化 學(xué)（J Biol Chem.)285:24290-24298,2010)和來(lái)自有包膜病毒的表面糖蛋白的各種長(zhǎng) 度的融合肽（14-30aa)(例如流感病毒、HIV和呼吸道合胞病毒）。融合肽的C-末端 經(jīng)常沒(méi)有統(tǒng)一的截止點(diǎn)。這樣，在已發(fā)表的文獻(xiàn)里所描述或用的融合肽的長(zhǎng)短差異很 大。以流感病毒為例，其融合肽可由主要包膜蛋白HA的HA2部分的前l(fā)-13aa(H 〇rvath 等人，免疫學(xué)快報(bào)（Immunol. Letters) 60:127-136, 1998)、l_14aa (Chun 等人，疫苗 (Vaccine) 26:6068-6076, 2008)、l-21aa(Sui 等人，自然結(jié)構(gòu)與分子生物學(xué)（Nat. Struct. Mol. Biol.) 16:265 - 273, 2009)、l-23aa (Cross 等人，蛋白質(zhì)和肽快報(bào)（Protein and Peptides Letters) 16:766-778, 2009)、l_24aa (Tamm and Han,生物科學(xué)報(bào)告（Bioscience Reports)20:501_518, 2000)、或 l_38aa(Vareckova 等人，單克隆抗體研究趨勢(shì)（Trends in Monoclonal Antibody Research) (Simmons MA, ed), pp 123-142,2005)組成。在其他 流感病毒蛋白中還已經(jīng)鑒定了許多其他高度保守的肽序列作為潛在的疫苗靶標(biāo)（Heiny等 人，PLoS One. 2: el 190, 2007 ;Ekiert 等人科學(xué)（Science) .324:246-251, 2009)。
[0011] 還存在具有有限數(shù)目的血清型但擁有免疫顯性表位的病原體，諸如結(jié)核分枝桿 菌（TB) (Mycobacterium tuberculosis)的 ESAT-6 蛋白（95aa)和 Ag85A(Brandt 等人， 免疫學(xué)（J. Immunol. ) 157:3527 - 3533, 1996 ;Santosuosso，M.等人傳染與免疫（Infect. Immun). 74:4634, 2006)。肽抗原的其他實(shí)例包括來(lái)自口蹄疫病毒（Beignon等人，Vet Tmmunol Immunopathol. 104: :273_80, 2005)、癥疾（Mahajan 等人，傳染與免疫（Infect. Immun) .S印，2010)、腸道病毒 71 (Foo 等人，病毒研究（Virus Res. ) 125:61 - 68, 2007)、炭 疽的保護(hù)性抗原（Oscherwitz等人，免疫學(xué)（J. Immunol. ) 185:3661-3668, 2010)和細(xì)菌粘 附蛋白（Yakubovics，N.等人分子生物學(xué)（Mol. Biol. )55:1591, 2005)的那些。
[0012] 除了感染性疾病以外，還正在對(duì)癌癥和其他疾病狀態(tài)開(kāi)發(fā)基于肽的疫苗。來(lái)源 于腫瘤相關(guān)抗原（TAA)的小肽已經(jīng)被鑒定為針對(duì)腫瘤或癌癥的疫苗候選物（Kanodia和 Kast,疫苗專(zhuān)家述評(píng)（Expert Rev Vaccines) .7:1533-1545, 2008 ;Cheever 等人，臨床癌 癥研究（Clin Cancer Res.) 15:5323_37, 2009 ;0ka 等人，免疫學(xué)新見(jiàn)（Curr. Opinion in Immunol.) 20:211-220)。它們包括來(lái)自各種癌癥的WTl蛋白的肽，來(lái)自乳腺癌相關(guān)HER2/ neu蛋白的GP2肽，來(lái)自前列腺癌的NY-ES01和來(lái)自黑色素瘤的多種肽。另外，β -淀粉樣肽 用作阿爾茲海默病的候選疫苗（Lemere,腦研究進(jìn)展（Prog Brain Res. ) 175:83-93,2009; Verdoliva 等人，人類(lèi)免疫（Human Vaccines) .6:1-2, 2010) 〇
[0013] 然而，肽抗原自身經(jīng)常是誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的弱免疫原。為了克服這一缺陷，肽抗原可 以與載體蛋白化學(xué)連接或使用重組DNA技術(shù)作為融合蛋白來(lái)增強(qiáng)針對(duì)它們的免疫應(yīng)答。
[0014] 診斷學(xué)
[0015] 診斷劑是在用于診斷感染性或非感染性疾病的診斷測(cè)試中使用的試劑。其可以是 用于檢測(cè)特異性抗體的抗原，或結(jié)合或檢測(cè)受體的配體，或反之亦然。診斷劑還包括用于檢 測(cè)特異性抗原或與特異性抗原相關(guān)的組織或病原體的特異性抗體。該特異性抗體為單克隆 或多克隆的，其可以用抗原在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生。通過(guò)將來(lái)自被免疫動(dòng)物的脾細(xì)胞和骨髓瘤 細(xì)胞諸如SP2/0融合來(lái)獲得單克隆抗體。
[0016] 來(lái)自病原體或疾病狀態(tài)的保守蛋白或肽抗原作為診斷劑可以非常有用。如果它們 與載體蛋白連接或融合，則它們?cè)谠\斷測(cè)試中的應(yīng)用可以被極大地改善。這對(duì)于肽抗原來(lái) 說(shuō)更是如此，因?yàn)檩d