一種質(zhì)粒dna的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于DNA的制備方法技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種質(zhì)粒DNA的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]高質(zhì)量的DNA對于進行高效的轉(zhuǎn)染至關(guān)重要，以前研究者使用CsCl梯度離心得到的DNA進行轉(zhuǎn)染，但是這種方法既需要昂貴的超速離心機，又費時費力，目前很少有人使用。目前超純質(zhì)粒的提取大多應用基于柱層析技術(shù)建立的純化試劑盒，這以德國QIAGEN公司的產(chǎn)品最為著名。QIAGEN公司利用基于專利的陰離子交換層析技術(shù)，在70分鐘內(nèi)，每次可得到20 μ g-10mg相當于2次CsCl超離心純度的質(zhì)粒DNA，但這種試劑盒的價格對大多數(shù)國內(nèi)實驗室來說是難以承受的。Saporito-1rwin SM等人m建立了手工提取質(zhì)粒的方法，聲稱該方法快捷(耗時三小時內(nèi))、成本低廉，純化的質(zhì)粒達到了用QIAGEN柱純化的質(zhì)粒的相同質(zhì)量。但在實際應用中，發(fā)現(xiàn)Saporito-1rwin SM方法提取質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率遠低于QIAGEN柱純化質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率，以致于影響后續(xù)實驗的進行。所以我們在Saporito-1rwinSM方法的基礎(chǔ)上作了進一步改進，提出了耗時較短，操作簡便，安全無污染的高純度質(zhì)粒提取方法，所提質(zhì)粒純度確實達到與用QIAGEN公司試劑盒所提的質(zhì)粒純度相篦美的程度。該方法雖然沒有QIAGEN試劑盒快捷，但由于國內(nèi)人力資源豐富而廉價，所以還是值得推廣。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明就是針對上述問題，提供一種純度高的質(zhì)粒DNA的制備方法。
[0004]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明包括以下步驟。
[0005]1)挑取含有質(zhì)粒的單菌落接種到具有相應抗性的LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)過夜.取過夜培養(yǎng)的菌液，接種到具有相應抗性的LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)。
[0006]2)轉(zhuǎn)移菌液至離心瓶中，離心，去上清。
[0007]3)將細菌沉淀重懸溶液I中，劇烈振蕩，使菌體分散混勻。
[0008]4)加溶液II，將離心瓶溫和顛倒數(shù)次混勻，并將離心瓶放置于冰上，使細菌裂解。
[0009]5)加入預冷的溶液III，將離心瓶溫和顛倒數(shù)次混勻，在冰上放置。離心lOmin。
[0010]6)將上清傾到進離心管中，加入異丙醇混勻，離心，去盡上清。
[0011]7)將沉淀溶于1TE，然后將溶液轉(zhuǎn)移到離心管，加入NH4Ac，顛倒數(shù)次混勻，在冰上放置，離心。
[0012]8)將上清均分進二個離心管，然后各加入異丙醇混勻，放置，離心，去盡上清。
[0013]9) 二個離心管各加入1TE溶解沉淀，然后將溶液合并到一個離心管中，水浴以降解RNA分子。
[0014]10)加入的PEG8000+1.6mol/L NaCl,顛倒數(shù)次混勻，在冰上放置，然后離心，
去盡上清。
[0015]11)將沉淀完全溶于ΤΕ，加入NH4Ac混勻，然后加入異丙醇，顛倒數(shù)次混勻，在冰上放置，離心，去盡上清。
[0016]12)加入乙醇洗滌沉淀和離心管內(nèi)壁，吸去乙醇，進行短暫的離心，然后盡量吸走剩余的乙醇.將離心管開蓋室溫放置，使沉淀表面的乙醇揮發(fā).最后視沉淀多少加入TE溶解沉淀。
[0017]作為一種優(yōu)選方案，本發(fā)明所述步驟1)挑取含有質(zhì)粒的單菌落接種到3ml具有相應抗性的LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)過夜.取2ml過夜培養(yǎng)的菌液，接種到200ml具有相應抗性的LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)11一 14小時。
[0018]2)轉(zhuǎn)移菌液至250ml離心瓶中，在4°C下4000rpm離心lOmin,去上清。
[0019]3)將細菌沉淀重懸6ml溶液I中，劇烈振蕩，使菌體分散混勻。
[0020]4)加6ml溶液II，將離心瓶溫和顛倒數(shù)次混勻，并將離心瓶放置于冰上5min，使細菌裂解。
[0021]5)加入5ml預冷的溶液III，將離心瓶溫和顛倒數(shù)次混勻，在冰上放置lOmin。在4°C下 10，000g 離心 lOmin。
[0022]6)將上清傾到進50ml離心管中，加入12ml異丙醇混勻，_20°C放置lOmin，在4°C下10，000g離心lOmin,去盡上清。
[0023]作為另一種優(yōu)選方案，本發(fā)明所述步驟7)將沉淀溶于850 μ 1ΤΕ，然后將溶液轉(zhuǎn)移到1.5m離心管，加入400 μ 1 10mol/L NH4Ac,顛倒數(shù)次混勻，在冰上放置lOmin,在4°C下 lO’OOOg 離心 lOmin。
[0024]8)將上清均分進二個1.5m離心管，然后各加入600 μ 1異丙醇混勻，_20°C放置lOmin,在4°C下12，000g離心lOmin,去盡上清。
[0025]9) 二個1.5m離心管各加入100 μ 1ΤΕ溶解沉淀，然后將溶液合并到一個1.5m離心管中，37 °C水浴20min以降解RNA分子。
[0026]10)加入200 μ 1的15%PEG8000+1.6mol/L NaCl,顛倒數(shù)次混勻，在冰上放置20min,然后在4°C下14,000g離心15min,去盡上清。
[0027]11)將沉淀完全溶于200 μ 1 ΤΕ，加入80 μ 1 10mol/L NH4Ac混勻，然后加入280 μ 1異丙醇，顛倒數(shù)次混勻，在冰上放置lOmin,在4°C下12，000g離心lOmin，去盡上清。
[0028]12)加入700 μ 1 70%乙醇洗滌沉淀和離心管內(nèi)壁，吸去70%乙醇，進行短暫的離心，然后盡量吸走剩余的乙醇.將離心管開蓋室溫放置lOmin，使沉淀表面的乙醇揮發(fā).最后視沉淀多少加入300-700 μ 1 ΤΕ溶解沉淀。
[0029]本發(fā)明有益效果。
[0030]本發(fā)明提取的質(zhì)粒質(zhì)量與QIAGEN plasmid midi Kit提取的質(zhì)粒質(zhì)量相比較，在理化指標上沒有差別，關(guān)鍵是對于哺乳動物胞轉(zhuǎn)染具有同樣的效率.所以本方法提取的質(zhì)粒的純度應達到QIAGEN試劑盒所宣稱超純狀態(tài)(相當于2倍Cscl超離心的質(zhì)粒純度)，隨質(zhì)粒不同，我們制備的質(zhì)粒產(chǎn)率也不同，一般是2-5 μ g質(zhì)粒/ml菌液.本方法所使用試劑十分廉價，導致提取得到質(zhì)粒成本非常低廉，雖然整個實驗耗時3—4個小時，由于國內(nèi)人力資源豐富而廉價，采用本方法制備用于哺乳動物細胞轉(zhuǎn)染的超純質(zhì)粒，在經(jīng)濟上十分劃算。
【具體實施方式】
[0031]本發(fā)明包括以下步驟。
[0032]1)挑取含有質(zhì)粒的單菌落接種到具有相應抗性的LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)過夜.取過夜培養(yǎng)的菌液，接種到具有相應抗性的LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)。
[0033]2)轉(zhuǎn)移菌液至離心瓶中，離心，去上清。
[0034]3)將細菌沉淀重懸溶液I中，劇烈振蕩，使菌體分散混勻。
[0035]4)加溶液II，將離心瓶溫和顛倒數(shù)次混勻，并將離心瓶放置于冰上，使細菌裂解。
[0036]5)加入預冷的溶液III，將離心瓶溫和顛倒數(shù)次混勻，在冰上放置。離心lOmin。
[0037]6)將上清傾到進離心管中，加入異丙醇混勻，離心，去盡上清。
[0038]7)將沉淀溶于1TE，然后將溶液轉(zhuǎn)移到離心管，加入NH4Ac，顛倒數(shù)次混勻，在冰上放置，離心。
[0039]8)將上清均分進二個離心管，然后各加入異丙醇混勻，放置，離心，去盡上清。
[0040]9) 二個離心管各加入1TE溶解沉淀，然后將溶液合并到一個離心管中，水浴以降解RNA分子。
[0041]10)加入的PEG8000+1.6mol/L NaCl,顛倒數(shù)次混勻，在冰上放置，然后離心，
去盡上清。
[0042]11)將沉淀完全溶于ΤΕ，加入NH4Ac混勻，然后加入異丙醇，顛倒數(shù)次混勻，在冰上放置，離心，去盡上清。
[0043]12)加入乙醇洗滌沉淀和離心管內(nèi)壁，吸去乙醇，進行短暫的離心，然后盡量吸走剩余的乙醇.將離心管開蓋室溫放置，使沉淀表面的乙醇揮發(fā).最后視沉淀多少加入ΤΕ溶解沉淀。
[0044]所述步驟1)挑取含有質(zhì)粒的單菌落接種到3ml具有相應抗性的LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)過夜.取2ml過夜培養(yǎng)的菌液，接種到200ml具有相應抗性的LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)11 一 14小時。
[0045]2)轉(zhuǎn)移菌液至250ml離心瓶中，在4°C下4000rpm離心lOmin,去上清。
[0046]3)將細菌沉淀重懸6ml溶液I中，劇烈振蕩，使菌體分散混勻。
[0047]4)加6m