一種抗動脈硬化魷魚蛋白質(zhì)短肽的分離方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及肽的制備，尤其是一種從魷魚內(nèi)臟中得到抗動脈硬化魷魚蛋白質(zhì)短肽 的分離方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著我國遠(yuǎn)洋捕撈業(yè)的迅速發(fā)展，魷魚已經(jīng)成為我國主要的水產(chǎn)加工原料。一直 以來魷魚的加工利用基本停留在其胴體上，內(nèi)臟、足、耳等一些加工副產(chǎn)物利用率較低，而 這些廢棄物中含有豐富的蛋白質(zhì)。魷魚內(nèi)臟約占魷魚濕重的15%，而魷魚內(nèi)臟含有約19%的 蛋白質(zhì)。目前，魷魚內(nèi)臟采用酶解發(fā)酵法，可作為制造醬油或天然調(diào)味品的原料。國外如西 班牙和日本已有魷魚醬油的生產(chǎn)與銷售，而國內(nèi)也有天然調(diào)味品研究報道。但是如何高效 對魷魚內(nèi)臟進(jìn)行水解以得到活性短肽的研究較少。
[0003] 心腦血管疾病是全球人類死亡的首因，動脈硬化是其中最常見而重要的類型，至 今還沒有良藥。近年研究發(fā)現(xiàn)短肽類活性物質(zhì)能夠抑制諸多器官如心、肺、腎、肝的纖維化。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)中魷魚內(nèi)臟利用率低、附加值小的不足，本發(fā)明提供一種工藝 合理、操作可行、具有抗動脈硬化活性、附加值高的抗動脈硬化魷魚蛋白質(zhì)短肽的分離方 法。
[0005] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：一種抗動脈硬化魷魚蛋白質(zhì)短肽的 分離方法，其特征在于：經(jīng)過下列工藝步驟： (1)原料預(yù)處理：選取新鮮的魷魚內(nèi)臟為原料，放入組織搗碎機(jī)中搗碎，按照1 : 1~3 的比例加入去離子水，混勻，得魷魚內(nèi)臟漿液； ⑵酶解：將步驟⑴中得到的魷魚內(nèi)臟漿液放入容器中，加入酶活力〇. 5~1萬U的 蛋白酶，置于預(yù)熱的恒溫水浴鍋中，恒溫溫度為55±5°C，計時酶解；酶解完畢后，將酶解液 置于沸水浴中加熱滅酶10-15min，冷卻至室溫后，控溫離心，得到魷魚內(nèi)臟酶解液； (3) 酶解液分離：將步驟（2)中得到的魷魚內(nèi)臟酶解液用去離子水溶解，采用HP-20樹 脂柱進(jìn)行層析，依次以水、20%、60%、80%的甲醇溶液對酶解液進(jìn)行梯度洗脫，收集甲醇洗脫 液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，得魷魚內(nèi)臟短肽。
[0006] 進(jìn)一步，本發(fā)明的一種抗動脈硬化魷魚蛋白質(zhì)短肽的分離方法，其還經(jīng)過下列工 藝步驟： (4) 抗動脈硬化活性評價：將步驟（3)得到的魷魚內(nèi)臟短肽進(jìn)行HMG-CoA還原酶抑制 活性評價。
[0007] 所述的蛋白酶為堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、動物蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、木 瓜蛋白酶中的一種。
[0008] 所述的控溫離心是控制溫度4°C，離心機(jī)轉(zhuǎn)速控制6000~8000r/min，離心10~ 20min〇
[0009] 所述的HMG-CoA還原酶抑制活性評價，其方法為：圓底96孔平板孔內(nèi)注入2. 5 mmol/LHMG-CoA、2-8U/mgHMG-CoA還原酶、10mmol/LNADPH和魷魚內(nèi)臟短肽，構(gòu)成50yL 的反應(yīng)體系；在37°C于337nm處每隔4min連續(xù)測定80min，通過NADPH吸光度的變化以 評定魷魚內(nèi)臟短肽對HMG-CoA還原酶的抑制作用； 其HMG-CoA還原酶抑制率的計算公式為：
其中，在計算公式中，R為抑制率（%); 心和Κε分別為樣品和對照組的吸光度直線斜率。
[0010] 本發(fā)明采用酶解法制備魷魚內(nèi)臟酶解液，魷魚內(nèi)臟酶解液采用ΗΡ-20樹脂柱進(jìn) 行層析，依次以水、20%、60%、80%的甲醇溶液對酶解液進(jìn)行梯度洗脫，收集甲醇洗脫液，旋轉(zhuǎn) 蒸發(fā)濃縮，最終得到具有抗動脈硬化作用的活性短肽。本發(fā)明提取得到的魷魚內(nèi)臟短肽可 作為藥劑學(xué)方面的輔料，可制成供臨床應(yīng)用片劑、軟膠囊劑、顆粒劑、沖劑、口服液、注射劑， 其附加值高。本發(fā)明工藝合理、操作可行，適合規(guī)?；S生產(chǎn)，且提取得到的魷魚內(nèi)臟短 肽進(jìn)行HMG-CoA還原酶抑制活性評價，證明具有抗動脈硬化的活性。
【具體實施方式】
[0011] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。
[0012] 實施例1 一種抗動脈硬化魷魚蛋白質(zhì)短肽的分離方法，經(jīng)過下列工藝步驟： (1) 原料預(yù)處理：選取新鮮的魷魚內(nèi)臟為原料，放入組織搗碎機(jī)中搗碎，按照1 : 2的 比例加入去離子水，混勻，得魷魚內(nèi)臟漿液； (2) 酶解：將步驟（1)中得到的魷魚內(nèi)臟漿液放入容器中，加入酶活力8000U的堿性蛋 白酶，置于預(yù)熱的恒溫水浴鍋中，恒溫溫度為55°C，計時酶解，每隔10min用玻璃棒攪拌一 次；酶解完畢后，將酶解液置于沸水浴中加熱滅酶15min，冷卻至室溫后，控制溫度4°C，離 心機(jī)轉(zhuǎn)速控制8000r/min，離心10min，得到魷魚內(nèi)臟酶解液； (3) 酶解液分離：將步驟（2)中得到的魷魚內(nèi)臟酶解液用去離子水溶解，采用HP-20樹 脂柱進(jìn)行層析，依次以水、20%、60%、80%的甲醇溶液對酶解液進(jìn)行梯度洗脫，收集甲醇洗脫 液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，得魷魚內(nèi)臟短肽； (4) 抗動脈硬化活性評價：將步驟（3)得到的魷魚內(nèi)臟短肽進(jìn)行HMG-CoA還原酶抑制 活性評價；其中，所述的HMG-CoA還原酶抑制活性評價，其方法為：圓底96孔平板孔內(nèi)注 入 2. 5mmol/LHMG-CoA、5U/mgHMG-CoA還原酶、10mmol/LNADPH和魷魚內(nèi)臟短肽，構(gòu)成 50μL的反應(yīng)體系；在37°C于337nm處每隔4min連續(xù)測定80min，通過NADPH吸光度的 變化以評定魷魚內(nèi)臟短肽對HMG-CoA還原酶的抑制作用； 其HMG-CoA還原酶抑制率的計算公式為：其中，
在計算公式中，R為抑制率（%); 心和Κε分別為樣品和對照組的吸光度直線斜率。
[0013]實施例2 一種抗動脈硬化魷魚蛋白質(zhì)短肽的分離方法，經(jīng)過下列工藝步驟： (1)原料預(yù)處理：選取新鮮的魷魚內(nèi)臟為原料，放入組織搗碎機(jī)中搗碎，按照1 : 3的 比例加入去離子水，混勻，得魷魚內(nèi)臟漿液； (2) 酶解：將步驟（1)中得到的魷魚內(nèi)臟漿液放入容器中，加入酶活力10000U的中性 蛋白酶，置于預(yù)熱的恒溫水浴鍋中，恒溫溫度為50°C，計時酶解，每隔10min用玻璃棒攪拌 一次；酶解完畢后，將酶解液置于沸水浴中加熱滅酶l〇min，冷卻至室溫后，控制溫度4°C， 離心機(jī)轉(zhuǎn)速控制6000r/min，離心20min，得到魷魚內(nèi)臟酶解液； (3) 酶解液分離：將步驟（2)中得到的魷魚內(nèi)臟酶解液用去離子水溶解，采用HP-20樹 脂柱進(jìn)行層析，依次以水、20%、60%、80%的甲醇溶液對酶解液進(jìn)行梯度洗脫，收集甲醇洗脫 液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，得魷魚內(nèi)臟短肽； (4) 抗動脈硬化活性評價：將步驟（3)得到的魷魚內(nèi)臟短肽進(jìn)行HMG-CoA還原酶抑制 活性評價；其中，所述的HMG-CoA還原酶抑制活性評價，其方法為：圓底96孔平板孔內(nèi)注 入 2. 5mmol/LHMG-CoA、8U/mgHMG-CoA還原酶、10mmol/LNADPH和魷魚內(nèi)臟短肽，構(gòu)成 50μL的反應(yīng)體系；在37°C于337nm處每隔4min連續(xù)測定80min，通過NADPH吸光度的 變化以評定魷魚內(nèi)臟短肽對HMG-CoA還原酶的抑制作用； 其HMG-CoA還原酶抑制率的計算公式為： 其中，在計算公式中，R為抑制率（%);
心和Κε分別為樣品和對照組的吸光度直線斜率。
[0014] 實施例3 一種抗動脈硬化魷魚蛋白質(zhì)短肽的分離方法，經(jīng)過下列工藝步驟： (1) 原料預(yù)處理：選取新鮮的魷魚內(nèi)臟為原料，放入組織搗碎機(jī)中搗碎，按照1 : 1的 比例加入去離子水，混勻，得魷魚內(nèi)臟漿液； (2) 酶解：將步驟（1)中得到的魷魚內(nèi)臟漿液放入容器中，加入酶活力5000U的胰蛋 白酶，置于預(yù)熱的恒溫水浴鍋中，恒溫溫度為60°C，計時酶解，每隔10min用玻璃棒攪拌一 次；酶解完畢后，將酶解液置于沸水浴中加熱滅酶12min，冷卻至室溫后，控制溫度4°C，離 心機(jī)轉(zhuǎn)速控制7000r/min，離心15min，得到魷魚內(nèi)臟酶解液； (3) 酶解液分離：將步驟（2)中得到的魷魚內(nèi)臟酶解液用去離子水溶解，采用HP-20樹 脂柱進(jìn)行層析，依次以水、20%、60%、80%的甲醇溶液對酶解液進(jìn)行梯度洗脫，收集甲醇洗脫 液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，得魷魚內(nèi)臟短肽； (4) 抗動脈硬化活性評價：將步驟（3)得到的魷魚內(nèi)臟短肽進(jìn)行HMG-CoA還原酶抑制 活性評價；其中，所述的HMG-CoA還原酶抑制活性評價，其方法為：圓底96孔平板孔內(nèi)注 入 2. 5mmol/LHMG-CoA、2U/mgHMG-CoA還原酶、10mmol/LNAD