一種產(chǎn)γ-亞麻酸的拉曼被孢霉突變菌株及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物工程、生物技術(shù)、油脂工程等領(lǐng)域，具體涉及一種產(chǎn)γ-亞麻酸的 拉曼被孢霉的突變菌株，同時(shí)涉及該突變菌株的制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來(lái)，脂類(lèi)在人類(lèi)膳食中占據(jù)了重要地位，而脂肪酸則是脂類(lèi)中的重要組成部 分。其中，多不飽和脂肪酸（PUFAs)是所有生物生存和生長(zhǎng)不可缺少的一類(lèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)之一。 PUFAs主要包括α-亞麻酸（α-linolenicacid，ALA)、γ-亞麻酸（γ-linolenicacid， 簡(jiǎn)稱(chēng)GLA，下同）、花生四稀酸（Arachidonicacid，ARA)等，其中GLA具有廣泛的生理活性 和明顯的藥理作用。
[0003] γ-亞麻酸系統(tǒng)名為全順式6, 9, 12-十八碳三烯酸，非共輒立體構(gòu)型，其分子式為 C18H3(：02，是一種ω-6系列PUFAs。其物理性狀為無(wú)色油狀液體，分子中含有三個(gè)雙鍵使得 它具有高度的不飽和性，在高溫條件下很容易氧化，在堿性條件下也易異構(gòu)化反應(yīng)形成共 輒多烯酸。人們從食物攝取的亞油酸，經(jīng)去飽和酶的作用后轉(zhuǎn)化為GLA，繼而被轉(zhuǎn)化為雙高 亞麻酸（DGLA)及花生四烯酸（ARA)，再轉(zhuǎn)變成前列腺素El(PGEl)、白三烯（LT)和前列環(huán)素 I2(PGI2)等。GLA不僅可以治療糖尿病、高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化等病癥，還可以起到抗炎，抗 菌，抗腫瘤，抗HIV感染的作用，此外GLA還具有肥胖的治療、美容等功效，對(duì)增強(qiáng)人體的免 疫功能，治療帕金森氏癥等多種疾病也具有一定的療效，被高度評(píng)價(jià)為"21世紀(jì)功能性食 品主角"。
[0004] 20世紀(jì)初期，Hei-duschka首次從月見(jiàn)草的種子中發(fā)現(xiàn)γ-亞麻酸，目前全球只 有80多種高等植物種子中含有GLA，而其中含量超過(guò)5 %僅僅有32種，隨著人們對(duì)GLA的 生理活性功能的認(rèn)識(shí)和研究，其應(yīng)用范圍也越來(lái)越廣泛，然而這些野生資源生長(zhǎng)受環(huán)境、地 域、氣候等多因素影響，無(wú)法滿足國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)需求，而微生物發(fā)酵法與之相比具有其無(wú)法比 擬的優(yōu)點(diǎn)。目前，國(guó)內(nèi)外微生物發(fā)酵生產(chǎn)γ-亞麻酸主要通過(guò)菌種篩選、誘變和優(yōu)化發(fā)酵條 件等方法提高產(chǎn)量，所篩選的γ-亞麻酸的菌種主要有被孢霉屬（Mortierella)，小克銀漢 霉屬（Cunnigharrlalla)，毛霉屬（Mucor)，枝霉屬（Thamnidium)和根霉屬（Rhizopus)等。 近年來(lái)，大多研究主要針對(duì)已有菌種的改造和代謝優(yōu)化，但是γ-亞麻酸得產(chǎn)量提高很少， 而且目前公開(kāi)的有關(guān)γ-亞麻酸發(fā)明專(zhuān)利以小克銀漢霉、深黃被孢霉為主，現(xiàn)在已有人將 深黃被孢霉用于GLA的商業(yè)化生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種拉曼被孢霉突變菌株及其在發(fā)酵生產(chǎn) γ-亞麻酸中的應(yīng)用。該突變菌株為拉曼被孢霉（Mortierellaramanniana)HLY0902， 已于2015年9月21日送至中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心進(jìn)行保藏，保藏編號(hào)：CCTCCNO:M 2015569,地址：中國(guó)武漢菌種保藏中心。
[0006] 為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：
[0007] 本發(fā)明所述的拉曼被孢霉HLY0902誘變篩選方法是：將初始菌株拉曼被 孢霉（Mortierellaramanniana)經(jīng)過(guò)UV-LiCl誘變后，通過(guò)篩選獲得一株產(chǎn)y-亞 麻酸較高的菌株作為下一步誘變的初始菌株，此菌株再經(jīng)硫酸二乙酯誘變，最后通過(guò) 失水蘋(píng)果酰肼初篩、搖瓶發(fā)酵復(fù)篩獲得一株高產(chǎn)γ-亞麻酸的目標(biāo)菌株拉曼被孢霉 (Mortierellaramanniana)HLY0902。
[0008] 本發(fā)明所提供產(chǎn)γ-亞麻酸的菌種的誘變方法，具體操作步驟如下：
[0009] 1.菌種
[0010] 本發(fā)明使用自然篩選獲得的拉曼被孢霉（Mortierellaramanniana)作為出發(fā)菌 株。
[0011] 2.菌種活化
[0012] 將步驟[0010]所述菌種接種于PDA斜面培養(yǎng)基，在25~28°C條件下，培養(yǎng)7天觀 察菌落形態(tài)，并從中挑選生長(zhǎng)較好的菌種。將菌種活化2~3代。
[0013] 3.菌種預(yù)處理
[0014] 將成熟的拉曼被孢霉菌株制成孢子懸浮液，并稀釋106~10 8個(gè)孢子/mL，顯微鏡 血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。
[0015] 4.紫外一氯化鋰復(fù)合誘變
[0016] 取已稀釋的微萌發(fā)菌液10mL加入到放有磁力攪拌轉(zhuǎn)子的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，于紫外 燈下照射0.5min~2. 5min，照射距離15~30cm。取0.lmL照射后的菌液涂布于含有LiCl 誘變劑的平板，25~28°C避光倒置培養(yǎng)2~3天。
[0017] 5.紫外一氯化鋰誘變菌株的篩選
[0018] 從中挑選單個(gè)菌落接入種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為：25~28°C，110~130r/min，搖 床活化24~4811。轉(zhuǎn)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基復(fù)篩，接種量為10%~15%，培養(yǎng)條件：25~28°(：， pH自然，110~130r/min，培養(yǎng)6~7天。將篩選出的誘變菌株傳代培養(yǎng)8~10代，并比較 不同代菌種的菌體生物量、菌體產(chǎn)油率、γ-亞麻酸含量，篩選出高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)突變被孢霉菌株 HLY0223,作為下一次誘變的出發(fā)菌株。
[0019]6.硫酸二乙酯誘變篩選
[0020] (1)孢子懸浮液的制備：將HLY0223用無(wú)菌的磷酸緩釋液配成孢子懸浮液，并稀 釋成106~10 8個(gè)孢子/mL，顯微鏡血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。
[0021] (2)誘變處理：將上述孢子懸浮液與不同體積的硫酸二乙酯充分混合，使硫酸二 乙酯的體積分?jǐn)?shù)在〇· 1%~1.5%之間，25~28°C，110~130r/min震蕩處理40~60min， 完畢后用硫代硫酸鈉終止反應(yīng)。分別吸取誘變稀釋后的0.lmL涂布于不同濃度的失水蘋(píng)果 酰肼篩選平板，25~28°C避光倒置培養(yǎng)2~3天。
[0022] (3)篩選：按步驟[0018]的方法對(duì)誘變菌株進(jìn)行篩選，最終選擇HLY0902作為復(fù) 合誘變的最終菌株。
[0023] 本發(fā)明中所用培養(yǎng)基配方及配制方法如下：
[0024] 步驟[0012]中所述PDA斜面培養(yǎng)基包含以下組分：馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L， 瓊脂20g/L。配制方法如下：將100g馬鈴薯去皮，切成lcm3方塊加水，煮沸15~20min，用 四層紗布過(guò)濾，加入20g葡萄糖和20g瓊脂，攪拌使其溶解，定容至1000ml，分別量取15mL 培養(yǎng)基裝入試管中，于121°C滅菌30min后取出將其傾斜放置并冷卻。
[0025] 步驟[0018]中所述種子培養(yǎng)基包含以下組分：碳源40~60g/L，氮源5~7g/L， 無(wú)機(jī)鹽0. 3~3g/L，pH6. 0~7. 0,其中所述無(wú)機(jī)鹽為鉀鹽、鈉鹽、鎂鹽中的一種或幾種的 混合。
[0026] 步驟[0016]中所述LiCl誘變平板的配制方法如下：稱(chēng)取5gLiCl溶于10mL無(wú)菌 水，振蕩均勻后滅菌。再量取〇. 2~1. 2mLLiCl溶液，加入到60mL的PDA培養(yǎng)基中制成平 板，使其質(zhì)量濃度為0.2%~1.0%。
[0027] 步驟[0018]中所述發(fā)明中搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基包含以下組分：碳源75~85g/L，氮源 5~10g/L，無(wú)機(jī)鹽0. 01~5g/L，其中所述無(wú)機(jī)鹽為鉀鹽、鈉鹽、鎂鹽中的一種或幾種的混 合。
[0028] 步驟[0021]中所述失水蘋(píng)果酰肼篩選平板的配制方法如下：先配制一定濃度 的失水蘋(píng)果酰肼水溶液，然后將其經(jīng)過(guò)〇. 22μm的濾膜過(guò)濾除菌。加入PDA培養(yǎng)基（40~ 60°C)，配制不同濃度的篩選培養(yǎng)基，其梯度范圍在10mg/L~200mg/L。
[0029] 篩選出高產(chǎn)GLA的拉曼被孢霉突變株HLY0902,在微生物制備GLA中得到應(yīng)用，誘 變方法簡(jiǎn)單有效。
[0030] 本次發(fā)明獲得以下有益效果：
[0031] 本次發(fā)明通過(guò)紫外-氯化鋰-硫酸二乙酯復(fù)合誘變，篩選出一株高產(chǎn)GLA的突變 菌株即拉曼被孢霉HLY0902,從很大程度上提高了產(chǎn)物中γ-亞麻酸的含量，并且菌種在 連續(xù)遺傳十代之后，其菌體生物量、菌體產(chǎn)油率及γ-亞麻酸含量基本一致，遺傳穩(wěn)定性良 好，具有一定的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)意義。
【附圖說(shuō)明】
[0032] 圖1 :實(shí)施例2發(fā)酵液中γ-亞麻酸的氣相色譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0033] 為了能夠更好地理解本發(fā)明，下面給出具體實(shí)施例進(jìn)行描述，需要指出的是，以下 實(shí)施例中所描述的具體的各物料配比、工藝條件及其最終結(jié)果僅用于說(shuō)明本發(fā)明，該領(lǐng)域 的技術(shù)熟練人員根據(jù)上述本
【發(fā)明內(nèi)容】
對(duì)本發(fā)明做出的一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整仍屬于本 發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0034] 實(shí)施例1拉曼被孢霉菌株的紫外一氯化鋰誘變方法
[0035] 將初始菌株拉曼被孢霉（Mortierellaramanniana)進(jìn)行紫外一氯化鋰誘變，具體 步驟如下：
[0036] (1)菌種預(yù)處理
[0037] 取25°C條件下培養(yǎng)了 7天成熟的固體斜面菌種，加15~20mL無(wú)菌水，輕輕刮下， 經(jīng)5~6層紗布過(guò)濾，加玻璃珠震蕩，打散孢子。用顯微鏡血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，并稀釋成10 6~ 10s個(gè)孢子/mL。取5mL菌懸液接入50mL種子培養(yǎng)基中，25°C，125r/min，搖床活化4~8h， 至孢子微萌發(fā)。
[0038] (2)紫外一氯化鋰復(fù)合誘變
[0039] 取lmL的微萌發(fā)菌液和9mL無(wú)菌水均勻混合稀釋10倍，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，將其濃 度梯度稀釋成1〇6~108個(gè)孢子/mL。取已稀釋的菌液10mL加入到放有磁力攪拌轉(zhuǎn)子的無(wú) 菌培養(yǎng)皿中，在距離紫外燈25cm處，分別照射0. 5min，1.Omin，1. 5min，2.Omin，2. 5min。取 照射時(shí)間為〇. 5min的菌液0.lmL于紅燈下，加入0. 9mL