04 溶液（2〇mL X 3)、飽和 NaCl 溶液（2〇mL X 3)、飽和 NaHC03溶液（20mLX3)、飽和NaCl溶液（20mLX3)各洗三遍，有機層用無水Na2S04干燥，過濾、濾 液減壓濃縮至干，得到的黃色油狀物經硅膠柱層析純化（二氯甲烷/甲醇為洗脫劑），得到 的淡黃色固體，經薄層層析純化（二氯甲烷/甲醇為展開劑）得到16mg(14. 5% )標題化合 物，為白色固體。ESI-MS(m/z) :593[M+Na]+ ; ;Mp :162 ~164°C;[a ]D25 = -7. 34(c = 0· 10， 甲醇）；IR(KBr) :3383,3290,3120,2916,1732,1667,1639,1578,1543,1508,1454,1408， 1377,1339,1300,1254,1211，1103,1092,941，907,894,675 JH-NMR(300MHz，DMS0-d6) : δ / ppm = 8. 87 (s，1H)，8. 76 (d，J = 9. 0Hz，1H)，8. 51 (m，1H)，8. 34 (m，1H)，8. 19 (s，1H)，7. 35 (m， 5H)，5. 13 (s，2H)，4.70 (ddj! = 6.0Hz，J2 = 12.0Hz，1H)，4.35 (d，J = 6.0Hz，1H)，2.47 (m， 2H)，2. 03(m，1H)，2. 00(s，3H)，1. 77(m，4H)，1. 68(m，2H)，1. 54(m，2H)，l，24(s，1H)。
[0035] 實驗例1化合物5抗腫瘤細胞增殖活性評價
[0036] 本發(fā)明的化合物5用含1 % DMS0的PBS配制成所需濃度。共使用了 MCF-7 (人乳 腺癌細胞），U20S (人骨肉瘤細胞），SH_Sy5y (神經母細胞瘤細胞），HaCaT (人永生化表皮 細胞），HL60 (人早幼粒細胞白血病細胞），K562 (人白血病慢性粒細胞）6株腫瘤細胞。
[0037] 將生長狀態(tài)良好，處于對數(shù)生長期的細胞按照5 X 104個/mL的密度接種于96孔 板，每孔100 μ 1。在37°C、5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時，按預設的濃度梯度100 μ M，50 μ M， 25 μ Μ，12. 5 μ Μ，6. 25 μ Μ，加入經滅菌處理的本發(fā)明的化合物，采用阿霉素作對照。繼續(xù)培 養(yǎng)48小時后，每孔加25 μ 1濃度為5mg/mL的ΜΤΤ溶液，置于37°C孵育4小時，小心除去上清 液（懸浮細胞經離心后除去上清液）后每孔加入100 μ 1 DMS0 (二甲基亞砜），振蕩約15min 溶解沉淀。立即于酶標儀上570nm波長下測定O.D.(吸光度）值。計算抑瘤率及ICS。。結 果也列入表1。結果表明本發(fā)明的化合物對六種腫瘤細胞都沒有明顯的細胞毒作用。
[0038] 表1化合物5的體外抗腫瘤細胞增殖活性（IC5。，μ M)
[0040] 實驗例2化合物5的體內抗腫瘤活性評價
[0041] 測定前將本發(fā)明的化合物5加吐溫80助溶，溶于生理鹽水。無菌條件下取接種 于ICR小鼠7-10天的S180肉瘤，加入適量生理鹽水配制成瘤細胞懸液，細胞數(shù)為2 X 107/ mL，接種于健康雄性ICR小鼠前肢腋皮下，每只小鼠注射0. 2ml。腫瘤接種24h后，治療組 小鼠每日腹腔注射〇. 2ml化合物5的水溶液，連續(xù)給藥7天，劑量分別為為100nm〇l/kg和 20nmol/kg?？瞻捉M小鼠每日腹腔注射0. 2ml生理鹽水。以阿霉素（劑量為2μπι〇1/1^)作 陽性對照。實驗進行至第8天，稱小鼠體重，并剖取各組小鼠的腫瘤稱重，最后統(tǒng)計各組動 物的抑瘤率。實體瘤的療效以瘤重抑制百分率表示，計算如下：瘤重抑制率％=(空白組瘤 重-給藥組瘤重/空白組瘤重）Χ100%。以瘤重或百分抑瘤率表示化合物的活性,數(shù)據(jù)列 入表2。
[0042] 由表2可以看出，在100nmol/kg和20nmol/kg的劑量下，化合物5治療小鼠的瘤 重明顯小于含吐溫80的生理鹽水治療小鼠的瘤重，說明化合物5的有效劑量低達20nmol/ kg。這個有效劑量比發(fā)明人曾經公開的3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-AA-OBzl (其中 AA代表甘氨基酸或其它L-氨基酸殘基）的有效劑量1 μ mol/kg低50倍。
[0043] 表2化合物5對S180荷瘤小鼠的瘤重的影響
[0046] 瘤重表示為均值土SD g ;a)與生理鹽水組比較p < 0. 01。
[0047] 實驗例3化合物5的動靜脈旁路循環(huán)抗血栓實驗
[0048] 1)聚乙烯管的組裝：將聚乙烯管拉成一端為斜口的細管，定長為10. 0cm，分別為 右經靜脈（管徑較粗）及左頸動脈（管徑較細）插管；中段聚乙烯管定長為8. 0cm，血栓線 壓在頸動脈插管方向，插管前需在管中充滿肝素。
[0049] 2)手術：以20nmol/kg的劑量進行灌胃給藥，30分鐘后腹腔注射20 %的烏拉坦進 行麻醉。仰臥位將大鼠固定于鼠板上，剪開頸部皮膚，分離右頸總動脈及左頸靜脈，血管下 壓線，結扎遠心端，靜脈靠遠心端處剪一小口，進行靜脈端插管，注射肝素，系線固定，再用 動脈夾夾住動脈近心端，靠近遠心端方向剪一小口，進行動脈端結扎，系線固定后松開動脈 夾，建立體外循環(huán)旁路。循環(huán)15分鐘后先剪斷靜脈端觀察血液循環(huán)是否正常，若正常從動 脈端取出血栓線，在紙上沾干浮血后稱量并記錄其濕重，大鼠斷頸處死。每組大鼠15只，最 后進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計并評價化合物活性。數(shù)據(jù)列入表3。從表3可以看出，化合物5治療大鼠的 血栓重量明顯小于含吐溫80的生理鹽水治療大鼠的血栓重量。表明化合物5在發(fā)揮體內 抗腫瘤作用的劑量下，還具有體內抗動脈血栓生成的活性。
[0050] 表3.化合物抗栓活性評價
[0052] η = 13 ；
[0053] a，與空白對照（NS)比較ρ < (λ 01 ;
[0054] b，與空白對照（NS)比較ρ < 0. 01，與陽性對照相比ρ > 0. 05 ;
[0055] 實驗例4化合物5的抗炎活性評價實驗
[0056] 1)實驗方法
[0057] 20±2g ICR雄性小鼠隨機分為空白對照組、陽性用藥組及給藥組，小鼠使用前靜 息1天，操作間保持室內溫度22°C，每組小鼠10只。一次給藥30分鐘后往小白鼠的左耳 外廓涂二甲苯（0.03mL)，2小時后將小白鼠頸椎脫臼處死。將小鼠的左，右耳剪下，用直徑 7_的打孔器在兩耳的相同位置，取圓形耳片，分別稱重，求出兩圓耳片的重量差作為腫脹 度。腫脹度=左耳原片重量-右耳原片重量。
[0058] 2)給藥方法和劑量
[0059] 給藥方式為灌胃給藥?？瞻讓φ眨荷睇}水，給藥劑量為0. 2mL/20g ;陽性對照：阿 司匹林，給藥劑量為1. llmm〇l/kg ;本發(fā)明化合物5的給藥劑量為20nmol/kg.
[0060] 3)統(tǒng)計方法
[0061] 本實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計均采用t檢驗和方差分析，腫脹度以([士SD mg):表示。
[0062] 4)實驗結果
[0063] 從表4結果可以看出，化合物5治療組的鼠耳腫脹度與生理鹽水組相比具有顯著 性差異，表明化合物5在發(fā)揮體內抗腫瘤作用的劑量下，還具有抗炎作用。
[0064] 表4化合物5的體內抗炎活性評價
[0066] 注：a)n = 9 ;b)與生理鹽水組比較，p < 0· 01。
【主權項】
1. 下式的 3H-咪哇并[4,5-c]化巧-6-甲醜-Met-Arg(N〇2)-〇Bzl。2. 權利要求1的3H-咪哇并[4,5-c]化巧-6-甲醜-Met-Arg(N〇2)-〇Bzl的制備方法， 該方法包括： (1) k組氨酸在稀硫酸催化下與甲醒進行Pictet-Spengler縮合生成6S-4,5,6, 7-四 氨-3H-咪哇并[4,5-C]化巧-6-駿酸； (2) 6S-4,5,6, 7-四氨-3H-咪哇并[4,5-C]化巧-6-駿酸轉化為6S-4,5,6, 7-四 氨-3H-咪哇并[4,5-c]化巧-6-甲酸甲醋； (3) 6S-4,5,6,7-四氨-3H-咪哇并[4,5-c]化巧-6-甲醋用高儘酸鐘氧化為3H-咪哇 并[4,5-C]化巧-6-甲酸甲醋； (4)3H-咪哇并[4,5-c]化巧-6-甲酸甲醋在化0H溶液（2腳中皂化成3H-咪哇并[4， 5-C]化巧-6-甲酸； 巧)Boc-Met-OH與硝基精氨酸予醋偶聯(lián)得到Boc-Met-Arg(N〇2)-〇Bzl; 化)Boc-Met-Arg(N02)-0Bzl在4N氯化氨的己酸己醋溶液中得到 L-Met-Arg(N〇2)-〇Bzl; (7) 3H-咪哇并[4, 5-c]化巧-6-甲酸與kMet-Arg(N02) -OBzl殘基偶聯(lián)得到3H-咪哇 并[4,5-c]化巧-6-甲醜-Met-Arg(N〇2)-〇Bzl。3. 權利要求1的3H-咪哇并[4,5-c]化巧-6-甲醜-Met-Arg(N〇2)-〇Bzl對腫瘤細胞 增殖的抑制作用。4. 權利要求1的通式I的3H-咪哇并[4,5-c]化巧-6-甲醜-Met-Arg(N〇2)-〇Bzl對 荷S180小鼠腫瘤增長的抑制作用。5. 權利要求1的3H-咪哇并[4,5-c]化巧-6-甲醜-Met-Arg(N〇2)-〇Bzl作為抗腫瘤 藥物的應用。6. 權利要求1的通式I的3H-咪哇并[4,5-c]化巧-6-甲醜-Met-Arg(N〇2)-〇Bzl對 SD大鼠的抗血栓作用。7. 權利要求1的3H-咪哇并[4,5-c]化巧-6-甲醜-Met-Arg(N〇2)-〇Bzl作為抗血栓 藥物的應用。8. 權利要求1的通式I的3H-咪哇并[4,5-c]化巧-6-甲醜-Met-Arg(N〇2)-〇Bzl對 ICR小鼠炎癥的抑制作用。9. 權利要求1的3H-咪哇并[4,5-c]化巧-6-甲醜-Met-Arg(N〇2)-〇Bzl作為抗炎藥 物的應用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了下式3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Met-Arg(NO2)-芐酯。公開了它的制備方法、公開了它的抗腫瘤作用，抗血栓活性，以及抗炎活性三重活性，因而本發(fā)明公開了它在制備抗腫瘤，抗血栓和抗炎三重作用的藥物中的應用。
【IPC分類】C07K1/02, C07K5/062, A61P29/00, A61P35/00, A61P7/02, A61K38/05
【公開號】CN105315325
【申請?zhí)枴緾N201410327812
【發(fā)明人】趙明, 彭師奇, 吳建輝, 王玉記, 王佳楠, 吳建民, 劉程
【申請人】首都醫(yī)科大學
【公開日】2016年2月10日
【申請日】2014年7月10日