一種生物轉(zhuǎn)化制備3-琥珀酰吡啶的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種3-班巧酷化晚的制備方法，尤其是設(shè)及一種生物轉(zhuǎn)化制備3-班 巧酷化晚的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 尼古下（nicotine)，又稱煙堿，是煙草中最主要的生物堿，同時(shí)也是卷煙中的有害 成分之一，是吸煙產(chǎn)生煙癒和依賴性的主要因素。在卷煙工業(yè)中產(chǎn)生了大量含有尼古下的 "有害的危險(xiǎn)廢物"，其中的尼古下能夠通過(guò)地下水或者空氣進(jìn)入環(huán)境中，會(huì)對(duì)環(huán)境及人類 健康造成極大的危害。
[0003] 我國(guó)是卷煙生產(chǎn)大國(guó)，在煙草加工過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生約20%~30%廢次煙葉，除此之 外各煙廠中積存的大量煙末，W及大量丟棄的上部煙葉和煙花等，運(yùn)些煙草工業(yè)下腳料的 利用率很低，廢棄后不僅造成浪費(fèi)，還對(duì)環(huán)境產(chǎn)生污染。從運(yùn)些煙葉種植及卷煙加工中產(chǎn)生 的下腳料中提取尼古下的技術(shù)已經(jīng)發(fā)展比較成熟，從傳統(tǒng)的水蒸氣蒸饋法，二次萃取法到 "綠色"新型分離技術(shù)超臨界萃取法，通過(guò)運(yùn)些手段提取出尼古下，既可W減少其對(duì)環(huán)境污 染，又可W利用提出的尼古下作為醫(yī)藥和生物農(nóng)藥產(chǎn)品開(kāi)發(fā)的工業(yè)原料。
[0004] 3-班巧酷化晚（3-succino^-py;ridine，SP)，是假單胞菌屬代謝尼古下的一種中 間產(chǎn)物，該化合物通過(guò)化學(xué)修飾后可W作為合成某些藥物和農(nóng)藥的前體，具有較高的利用 價(jià)值。目前，有關(guān)3-班巧酷化晚生產(chǎn)的研究報(bào)道還不充分，如何有效獲得3-班巧酷化晚成 為人們希望解決的問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供一種生物轉(zhuǎn)化制備3-班巧酷化晚的方法，包括W下 步驟：
[0006] 步驟一、底物的獲?。簩⒑峁畔碌囊后w作為生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)的底物；
[0007] 步驟二、構(gòu)建生物轉(zhuǎn)化用的菌株：將能代謝尼古下的惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida)的spmA基因敲除，得到惡臭假單胞菌（Pseudomonasputida)基因工程菌；
[0008] 步驟S、菌株培養(yǎng)與收集：將步驟二中得到的惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida)基因工程菌進(jìn)行培養(yǎng)后收集菌體全細(xì)胞作為生物催化劑；
[0009] 步驟四、轉(zhuǎn)化反應(yīng)：將步驟=中收集的菌體全細(xì)胞與步驟一中的底物在P冊(cè).0~ 10. 0 (優(yōu)選地是抑7. 0~9. 0)，20~45°C溫度下，120~18化pm振蕩條件下反應(yīng)，直至尼古 下完全被降解后終止反應(yīng)，或者定時(shí)向反應(yīng)液中補(bǔ)加底物，維持尼古下濃度在Ig/L W上反 應(yīng)6~15小時(shí)；
[0010] 步驟五、產(chǎn)物分離：將步驟四反應(yīng)結(jié)束后的產(chǎn)物在5000~1000化pm轉(zhuǎn)速下離屯、 10~30分鐘，取上清液置于真空度0. 08~0.1 MPa, 45~65°C的條件下減壓蒸饋至原體積 的1/20~1/50,加入鹽酸調(diào)節(jié)抑在2. 0~4. 0,靜置、沉淀，然后用抽濾方法去除水溶液， 將沉淀干燥，得到3-班巧酷化晚。其中優(yōu)選地是靜置待3-班巧酷化晚充分沉淀。最后干 燥得到的3-班巧酷化晚為白色粉末。步驟一與步驟二和步驟=是獨(dú)立分別進(jìn)行的，不存在 先后順序。
[0011] 進(jìn)一步地，步驟一W廢次煙葉作為生物轉(zhuǎn)化的原料，利用水浸提廢次煙葉獲得煙 葉浸提液或利用二次萃取的方法從廢次煙葉中獲得尼古下提取液，煙葉浸提液或尼古下提 取液作為生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)的底物。
[0012] 其中，步驟一中的煙草浸提液的獲取方法是：將廢次煙葉和純水按照質(zhì)量比 1:10~15混合，在50~60°C下攬拌處理3~5小時(shí)，過(guò)濾除去廢次煙葉，獲得煙草浸提液。
[0013] 其中，步驟一中的尼古下提取液的獲取方法是：將廢次煙葉烘干后粉碎成煙末，將 煙末與蒸饋水按照1:10~1:15混合均勻，用氨氧化鋼調(diào)節(jié)抑在11~14,攬拌2~4小時(shí) 后靜置12~24小時(shí)，過(guò)濾除去濾渣獲得含有煙堿的濾液，加入濾液體積的1/5~1/10氯 仿進(jìn)行萃取，萃取溫度為35~40°C，抑控制在11~14,攬拌萃取2~4小時(shí)后加入濾液 體積的1/5~1/10稀硫酸進(jìn)行反萃，稀硫酸的抑為1~4,利用分液漏斗除去有機(jī)相，獲得 硫酸煙堿水溶液，即為尼古下提取液。
[0014] 進(jìn)一步地，步驟二中的惡臭假單胞菌（Pseudomonasputida)是于2005年04月18 日保藏于位于武漢的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中屯、，保藏編號(hào)為CCTCCM205038的菌株。運(yùn)里被 命名為惡臭假單胞菌（Pseudomonasputida)S16。具體保藏信息可見(jiàn)ht1:p://www.cctcc. o;rg/sci/mic;robe_common/sea;rchl_result.地P?ptzyh= 1542C0001WHM205038。
[0015] 進(jìn)一步地，步驟二中的惡臭假單胞菌（Pseudomonasputida)基因工程菌的具體構(gòu) 建方法是包括W下步驟：
[0016] 步驟甲、PCR擴(kuò)增spmA基因：W惡臭假單胞菌（Pseudomonasputida)CCTCCM 205038為模版，spm-F和spm-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得PCR產(chǎn)物；spm-F引物序列（SEQ IDNO. 1)為CCACGTCGACCAAGTTAACTGGTTATGCGAC,含有酶切位點(diǎn)為SalI;spm-R引物序列 (沈QIDNO. 2)為CCACGAATTCAGTCCTTGGCCGAAACTTTGC，含有酶切仿點(diǎn)為EcoRI；
[0017] 步驟乙、質(zhì)粒構(gòu)建與轉(zhuǎn)化：將步驟甲中的PCR產(chǎn)物和穿梭質(zhì)粒分別用限制性內(nèi)切 酶SalI和EcoRI進(jìn)行酶切，獲得酶切產(chǎn)物，并回收、連接酶切產(chǎn)物得到帶有PCR產(chǎn)物的 穿梭質(zhì)粒；利用熱激法將帶有PCR產(chǎn)物的穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，再經(jīng)過(guò)酶切及測(cè)序 驗(yàn)證，得到供體菌；
[0018] 步驟丙、雙親雜交：將步驟乙中得到的供體菌和W惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida)CCTCCM205038作為受體菌的兩菌株通過(guò)雙親雜交的方法獲得惡臭假單胞菌 (Pseudomonasputida)基因工程菌。
[0019] 進(jìn)一步地，步驟=中菌株培養(yǎng)包括W下=個(gè)步驟：
[0020] 步驟曰、斜面培養(yǎng)：將步驟二中的惡臭假單胞菌（Pseudomonasputida)基因工程 菌接種到固體斜面LB培養(yǎng)基，25~37-°C培養(yǎng)10~24小時(shí)，固體斜面LB培養(yǎng)基組含有 1%~3%瓊脂糖和50~lOOmg/L卡那霉素；
[0021] 步驟b、種子培養(yǎng)：將步驟a中斜面上長(zhǎng)勢(shì)良好的菌體在無(wú)菌的環(huán)境中轉(zhuǎn)接到LB 液體培養(yǎng)基或者甘油液體培養(yǎng)基中，在25~37-°C培養(yǎng)8~24小時(shí)，獲得種子液，LB液體 培養(yǎng)基和甘油液體培養(yǎng)基中均含有卡那霉素50~lOOmg/L和尼古下0. 5~1. 5g/L; 陽(yáng)0巧步驟C、放大培養(yǎng)：將步驟b中的種子液按照體積比1%~5%接種量轉(zhuǎn)接到LB液 體培養(yǎng)基或者甘油液體培養(yǎng)基中，25~37°C下120~20化pm培養(yǎng)8~24小時(shí)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng) 中期，LB液體培養(yǎng)基和甘油液體培養(yǎng)基中均含有50~lOOmg/L卡那霉素和0. 5~I. 5g/L尼古下。
[0023] 進(jìn)一步地，步驟a~C中的菌體培養(yǎng)溫度為29~3rC。步驟a中的菌體培養(yǎng)時(shí)間 為10~14小時(shí)。步驟b和C中的菌體培養(yǎng)時(shí)間為12~16小時(shí)。步驟b和C中的培養(yǎng)基 中的尼古下濃度為0. 8~1. 2g/L。
[0024] 進(jìn)一步地，步驟四中的菌體全細(xì)胞參與反應(yīng)時(shí)的初始濃度是600nm下OD值為5~ 15個(gè)光密度，優(yōu)選地是8~11個(gè)光密度；步驟一中的尼古下在步驟四中參與反應(yīng)時(shí)的初始 濃度是1~5g/l，優(yōu)選地是2~4g/L;W上初始濃度均用水調(diào)制獲得。
[00巧]在本發(fā)明的生物轉(zhuǎn)化制備3-班巧酷化晚的方法的另一實(shí)施方式中，還包括步驟 六：產(chǎn)物鑒定：將步驟五中獲得的3-班巧酷化晚用高效液相色譜她LC)檢測(cè)其純度，用液 相-質(zhì)譜聯(lián)用巧SI-M巧和核磁波譜（NMR)的方法鑒定其結(jié)構(gòu)。
[0026] 進(jìn)一步地，步驟六中的NMR檢測(cè)分別檢測(cè)"CNMR和iHNMR，用AvanceIII400核磁 共振儀分析，溶劑為二甲基亞諷。步驟六中的ESI-MS用Agilent6230質(zhì)譜儀分析，溶劑為 甲醇。
[0027] 進(jìn)一步地，步驟四還包括反應(yīng)期間每小時(shí)取樣，用薄層層析CTLC)或者高效液相 色譜檢測(cè)3-班巧酷化晚的生成情況；薄層層析的反應(yīng)展層劑中氯仿：乙醇：甲醇：0. 5M氨 氧化鋼的體積比為30:15:2:1. 5 ;高效液相色譜的檢測(cè)條件是=AgilentllOO高效液相色譜 儀配備XDB-C18色譜柱，流動(dòng)相中0.IM硫酸：乙臘的體積比為85:15,流速為0. 5血/min， 檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm，柱溫為30-°C;步驟六中的高效液相色譜的檢測(cè)條件與步驟四中的高效 液相色譜的檢測(cè)條件相同。
[00測(cè)進(jìn)一步，步驟四中的轉(zhuǎn)化反應(yīng)發(fā)生在只有惡臭假單胞菌（Pseudomonasputida)基 因工程菌、底物尼古下和溶劑蒸饋水存在的反應(yīng)體系中。
[0029] 本發(fā)明將微生物菌株基因的定向改造、廢次煙葉中尼古下的提取與3-班巧酷 化晚的制備有機(jī)的結(jié)合在一起，利用一株經(jīng)定向改造后的惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida)基因工程菌作為生物催化劑，高效而穩(wěn)定的降解尼古下并且積累單一的代謝中間 物3-班巧酷化晚。本發(fā)明借助基因工程菌高效且特異性的生物催化功能，解決了野生型 菌株在轉(zhuǎn)化過(guò)程中產(chǎn)物3-班巧酷化晚很難積累且易被相關(guān)酶降解的問(wèn)題。本發(fā)明提供的 3-班巧酷化晚制備的方法，具有成本低廉，催化反應(yīng)體系簡(jiǎn)單，產(chǎn)物單一易于分離純化，反 應(yīng)耗時(shí)短、效率高的優(yōu)點(diǎn)。
[0030] 本發(fā)明提