測(cè)樣品，設(shè)置三個(gè)重復(fù)，以空白發(fā)酵培養(yǎng)基代替發(fā)酵 液作為陰性對(duì)照；于28°C放置24h后在倒置顯微鏡下觀察，蟲(chóng)體僵直或卷曲被視為擊倒，計(jì) 算線蟲(chóng)校正擊倒率。向24孔板中加入清水600μL，觀察恢復(fù)情況，不能恢復(fù)活性的記為死 亡，計(jì)算校正死亡率。
[0030] 校正擊倒率（％)= 100X(處理?yè)舻孤?對(duì)照擊倒率）八1_對(duì)照擊倒率）
[0031] 校正死亡率（％) =(1-恢復(fù)率）X校正擊倒率
[0032] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，菌株ΗΑ12420對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)的校正死亡率為66.0%。
[0033] (3)抗線蟲(chóng)活性菌株的復(fù)篩
[0034] 以南方、花生、爪哇根結(jié)線蟲(chóng)為供試對(duì)象，線蟲(chóng)通過(guò)盆栽西紅柿保存。菌株 HA12420CGMCCNo. 11063按實(shí)施例2的方法進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，檢測(cè)方法參照上述（2)進(jìn)行。將 活性菌株發(fā)酵液進(jìn)行20倍稀釋?zhuān)幚頃r(shí)間為24h和48h。菌株HA12420發(fā)酵液對(duì)供試根結(jié) 線蟲(chóng)都具有明顯的抑制作用，結(jié)果如表1。
[0035] 表1菌株HA12420發(fā)酵液稀釋20倍時(shí)抗根結(jié)線蟲(chóng)活性測(cè)定
[0036]
[0037] 實(shí)施例4菌株HA12420CGMCCNo. 11063的種屬鑒定
[0038] (1)形態(tài)與培養(yǎng)特性
[0039] 菌株HA12420在燕麥汁培養(yǎng)基、酵母粉-淀粉培養(yǎng)基、土豆汁培養(yǎng)基、無(wú)機(jī)鹽-淀 粉培養(yǎng)基上均生長(zhǎng)良好，形成豐富且長(zhǎng)的氣生菌絲和基內(nèi)菌絲。氣絲白色至灰褐色，分枝 少，長(zhǎng)、直或不規(guī)則彎曲，有橫隔，Z字形折曲，后期斷裂為橢圓形至長(zhǎng)柱形孢子，孢子表面光 滑（附圖1)。
[0040] (2)生理生化特征
[0041] 菌株HA12420可利用D-甘露醇、纖維二糖、半乳糖、D-海藻糖、麥芽糖和淀粉作為 唯一碳源，不能利用D-棉子糖、D-山梨醇、甘油、鹿糖等。能還原硝酸鹽，能水解淀粉和明 膠，但不能水解纖維素，不產(chǎn)生黑色素和H2S。
[0042] (3) 16S rDNA序列測(cè)定與系統(tǒng)發(fā)育分析
[0043] 菌株HA12420經(jīng)基因組提取、PCR擴(kuò)增，經(jīng)測(cè)序獲得1403bp的16SrDNA序列，核 苷酸序列在Genbank的登錄號(hào)為KJ419957。將該序列與EzBioCloud數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行 比對(duì)，發(fā)現(xiàn)菌株HA12420 與NocardiopsistrehalosiVKMAc-942T(AF105972)具有最高的 16SrDNA序列相似性（97. 5% )。
[0044] 本發(fā)明涉及的菌株HA12420(CGMCCNo. 11063)，經(jīng)分類(lèi)鑒定，屬于擬諾卡氏菌屬的 一個(gè)種，暫命名為Nocardiopsissp.HA12420,已于2015年月日在中國(guó)微生物菌種保藏管 理委員會(huì)普通微生物中心（CGMCC)進(jìn)行了菌種保藏，并證明存活，其保藏登記號(hào)為CGMCC No. 11063。保存地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。
[0045] 實(shí)施例5菌株HA12420CGMCCNo. 11063對(duì)南方根結(jié)線蟲(chóng)防效的盆栽實(shí)驗(yàn)
[0046] 選用西紅柿作為實(shí)驗(yàn)植物，以南方根結(jié)線蟲(chóng)為供試線蟲(chóng)，考察菌株HA12420CGMCC No. 11063對(duì)西紅柿盆栽苗根結(jié)線蟲(chóng)的防效。供試沙壤土經(jīng)100°C高溫消毒30min，經(jīng)檢查無(wú) 線蟲(chóng)存活，裝盆待用。病土混勻后線蟲(chóng)密度為5頭/10g，每盆裝土量為2. 5kg。
[0047] 將西紅柿種子用1%NaCIO表面消毒10min后，用無(wú)菌蒸餾水沖洗3遍，于培養(yǎng)皿 中催芽后播種。待苗齡達(dá)到4葉1心時(shí)進(jìn)行定植，同時(shí)進(jìn)行接種。實(shí)驗(yàn)共設(shè)4個(gè)處理，分別 為對(duì)照組CK(只接病土）、處理1(病土+50mL菌劑）、處理2(病土 +接種100mL菌劑）和 處理3(病土+2%阿維菌素）。處理組采用的菌劑由實(shí)施例2制備得到。每隔一個(gè)月沖施 一次，每個(gè)處理3次重復(fù)，每重復(fù)10株苗。在番茄苗定植后30d及45d時(shí)采樣（每次采樣 10株取平均值），觀察西紅柿生物學(xué)性狀，測(cè)定病情指數(shù)、防治效果及產(chǎn)量等指標(biāo)。
[0048] 通過(guò)對(duì)西紅柿一個(gè)周期的跟蹤實(shí)驗(yàn)，從西紅柿植株生物學(xué)性狀可以看出，不論是 西紅柿植株株高、莖粗，還是西紅柿果實(shí)產(chǎn)量、果實(shí)大小，使用菌劑組各項(xiàng)指標(biāo)均與阿維菌 素相當(dāng)，明顯優(yōu)于空白對(duì)照CK。3個(gè)處理組防治效果分別為59. 5%、64. 3%與62. 0%，具體 結(jié)果見(jiàn)表2。
[0049] 表2菌劑和阿維菌素對(duì)西紅柿的防治效果
[0050]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種放線菌，其特征在于所述的放線菌為擬諾卡氏菌（Nocardiopsis)，菌株代號(hào) 為HA12420,該菌株于2015年7月9日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物 中屯、，地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，菌種保藏號(hào)為 CGMCCNO. 11063。2. 權(quán)利要求1所述放線菌的特征在于，其16SrDNA的序列為：3. -種權(quán)利要求1所述的放線菌的發(fā)酵液，其特征在于W所述擬諾卡氏菌HA12420經(jīng) 種子培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)和發(fā)酵液純化制成。具體包括W下步驟： (1) 種子培養(yǎng)：從斜面挑取經(jīng)活化的單菌落接入種子培養(yǎng)基，28-37Γ培養(yǎng)2-4天。培 養(yǎng)基：酵母粉4. 0-8.Og，麥芽提取物2. 0-10.Og，葡萄糖1. 0-4.Og，50-100 %陳海水lOOOmL， pH7. 2-7. 4。 (2) 發(fā)酵培養(yǎng)：按5-10 %的接種量接入種子培養(yǎng)液，28-37 °C、180r/min搖瓶培養(yǎng)5-8 天。培養(yǎng)基：玉米粉4. 0-10.Og，大豆粉4. 0-10.Og，可溶性淀粉1. 0-5.Og，K2HP〇4 0. 1-0. 5邑， 50-100 % 陳海水 1000ml，pH7. 2-7. 4。 (3) 發(fā)酵液純化：收集發(fā)酵5-8天的發(fā)酵液，移入離屯、管中，3000-5000r/min離屯、 5-15min，上清液即為放線菌發(fā)酵液。4. 權(quán)利要求1所述放線菌的應(yīng)用，其特征在于該菌發(fā)酵液對(duì)南方、花生、爪哇根結(jié)線蟲(chóng) 存在明顯的毒殺活性。5. -種權(quán)利要求3或4所述的放線菌菌劑的應(yīng)用，其特征在于所述菌株及其發(fā)酵液在 制備毒殺植物根結(jié)線蟲(chóng)藥物中的應(yīng)用。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一株具有殺線蟲(chóng)放線菌及其制備方法和應(yīng)用。所述的放線菌為擬諾卡氏菌(Nocardiopsis)HA12420，該菌株于2015年7月9日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC？No.11063。所述放線菌發(fā)酵液的制備方法，包括種子培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)、發(fā)酵液純化步驟；該放線菌發(fā)酵液對(duì)南方、爪哇、花生根結(jié)線蟲(chóng)都存在明顯的殺蟲(chóng)活性，適用于防治蔬菜、花卉、瓜類(lèi)、果園等作物的根結(jié)線蟲(chóng)，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有良好的開(kāi)發(fā)前景。CGMCC No.1106320150709
【IPC分類(lèi)】C12R1/01, C12N1/20, A01N63/00, A01P5/00, A01N63/02
【公開(kāi)號(hào)】CN105238709
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510584852
【發(fā)明人】黃惠琴, 鮑時(shí)翔, 朱軍, 孫前光, 劉敏, 鄒瀟瀟
【申請(qǐng)人】中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所
【公開(kāi)日】2016年1月13日
【申請(qǐng)日】2015年9月9日