一株具有殺根結(jié)線蟲活性的海洋放線菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一株具有殺根結(jié)線蟲活性的海洋放線菌，以及其在防治植物根結(jié)線蟲 上的應(yīng)用，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 根結(jié)線蟲（Meloidogyne spp.)是一類分布廣、危害大、難以防治的植物寄生線 蟲。已報(bào)道的根結(jié)線蟲種類超過90個(gè)，其中南方根結(jié)線蟲（M. incognita)、花生根結(jié)線蟲 (M. arenaria)、爪唾根結(jié)線蟲（M. javanica)和北方根結(jié)線蟲（M. hapla)屬于發(fā)生較為普遍 的四大優(yōu)勢種群。由根結(jié)線蟲為害植物根系引起的根結(jié)線蟲病是一種世界性的土傳病害， 給許多國家的農(nóng)林、園藝等產(chǎn)業(yè)造成巨大損失。
[0003] 目前根結(jié)線蟲的防治方法主要有農(nóng)業(yè)防治、物理防治、化學(xué)防治及生物防治等。以 化學(xué)殺線劑為主的防治措施存在很多弊端，如：破壞環(huán)境、危害人體健康、易產(chǎn)生耐藥性等， 正逐步被限制使用。生物防治以其具有環(huán)境友好、安全無污染的優(yōu)點(diǎn)愈來愈受到人們重視。
[0004] 放線菌是自然界中一類重要的資源微生物，其次生代謝產(chǎn)物被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、 食品及農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，目前使用的醫(yī)藥及農(nóng)業(yè)抗生素中60%以上來自于放線菌。在線蟲生防 資源中，放線菌主要以拮抗或毒殺方式作用于線蟲，而其毒力因子又主要是菌株所產(chǎn)生的 抗生素。除阿維菌素（Avermectin，AVM)這一農(nóng)用抗生素中線蟲防治的首選藥物外，相 繼報(bào)道兼具線蟲毒殺活性的還有：尼可霉素（Nikkomycin)、瀏陽霉素（liuyangmycin)、南 昌霉素（Nanchangmycin)、華光霉素（huaguangmycin)、多殺菌素（spinosad)、四活菌素 (Tetranactin)、越霉素A(DestomycinA)以及潮霉素B(HygromycinB)等等。
[0005] 海洋是微生物的巨大生存寶庫。為適應(yīng)海洋的特殊生態(tài)環(huán)境，海洋微生物形成了 獨(dú)特的生理特性和代謝特性，進(jìn)而產(chǎn)生了多種多樣的復(fù)雜的次生代謝產(chǎn)物，成為人類尋找 和開發(fā)具有藥用或其他用途天然產(chǎn)物的重要源泉。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種具有殺根結(jié)線蟲活性的放線菌及其制備方法和應(yīng)用。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0008] 本發(fā)明所提供的具有毒殺根結(jié)線蟲活性的放線菌HA12420,已于2015年7月9日 在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（CGMCC)進(jìn)行了菌種保藏，并證明存 活，其保藏登記號為CGMCCNo. 11063。保存地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院，中國科 學(xué)院微生物研究所。所述放線菌HA12420屬于細(xì)菌域、放線菌門、放線菌綱、放線菌目、擬諾 卡氏菌科、擬諾卡氏菌屬。
[0009] 所述的放線菌HA12420,保藏號為CGMCCNo. 11063,分類鑒定為擬諾卡氏菌屬，命 名為Nocardiopsissp.HA12420〇
[0010] 放線菌HA12420具有以下微生物特性：基內(nèi)菌絲和氣生菌絲發(fā)育良好，長，氣絲白 色至灰褐色，分枝少，長、直或不規(guī)則彎曲，有橫隔，Z字形折曲，后期斷裂為橢圓形至長柱形 孢子，孢子表面光滑。該菌株16SrDNA序列在GenBank的保存號為KJ419957。
[0011] 實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的根結(jié)線蟲拮抗菌為擬諾卡氏菌HA12420(保藏號為CGMCC No. 11063)，對南方根結(jié)線蟲（M.incognita)、花生根結(jié)線蟲（M.arenaria)、爪唾根結(jié)線蟲 (M.javanica)等根結(jié)線蟲都有很強(qiáng)的毒殺作用。
[0012] 所述的放線菌HA12420,保藏號為CGMCCNo. 11063,從發(fā)酵液中提取的活性成份也 屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0013] 本發(fā)明的放線菌HA12420(保藏號為CGMCCNo. 11063)，分離自八門灣紅樹林底 泥。實(shí)驗(yàn)證明，該菌株接種植物后能有效滅殺根結(jié)線蟲，為植物根結(jié)線蟲的防治提供了一種 新的生物農(nóng)藥來源。本發(fā)明的擬諾卡氏菌HA12420,是一株具有良好生防應(yīng)用前景的菌株。
[0014] 下面結(jié)合說明書附圖和【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
【附圖說明】
[0015] 圖1為本發(fā)明所述菌株HA12420的形態(tài)特征掃描電鏡照片，X6600。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明：
[0017] 實(shí)施例 1 :菌株HA12420CGMCCNo. 11063 的分離
[0018] 從海南省八門灣紅樹林采集底泥樣品。自然風(fēng)干7天后，取5g樣品溶于45ml無 菌陳海水中，制成土壤懸液。用無菌陳海水逐漸稀釋為10 2、10 3、10 4倍，吸取不同稀釋度 的樣品100y1，涂布于放線菌分離培養(yǎng)基，將分離平板置于28°C培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)。待菌落 長出時(shí)，挑取形態(tài)、顏色不同的菌落劃線于高氏一號合成培養(yǎng)基上進(jìn)行純化，直至得到純培 養(yǎng)。經(jīng)初步排重后，編號，保存。
[0019]實(shí)施例 2:菌株HA12420CGMCCNo. 11063 的培養(yǎng)
[0020] (1)斜面培養(yǎng)：28°C培養(yǎng)7天。培養(yǎng)基：酵母粉4. 0g，麥芽提取物10. 0g，葡萄糖 4. 0g，50% 陳海水 1000mL，ρΗ7· 2-7. 4。
[0021] (2)種子培養(yǎng)：從斜面挑取經(jīng)活化的單菌落接入種子培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)2-3天。培 養(yǎng)基：酵母粉4.0g，麥芽提取物10.0g，葡萄糖4.0g，50%陳海水1000mL，pH7. 2-7.4。
[0022] (3)發(fā)酵培養(yǎng)：按5 %的接種量接入種子培養(yǎng)液，28°C、180r/min搖瓶培養(yǎng)6天。 培養(yǎng)基：玉米粉10. 〇g，大豆粉10. 〇g，可溶性淀粉5. 0g，K2HP040 . 5g，50%陳海水1000ml， ρΗ7· 2-7. 4〇
[0023] 實(shí)施例3:菌株ΗΑ12420CGMCCNo. 11063抗根結(jié)線蟲活性檢測
[0024] 菌株HA12420CGMCCNo. 11063按實(shí)施例2的方法進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，收集發(fā)酵6天的 發(fā)酵產(chǎn)物，l〇〇〇〇r/min離心10min，取上清液用0. 22μm無菌濾膜過濾，備用。
[0025] (1)供試線蟲的準(zhǔn)備
[0026] 初篩的供試線蟲由野外采集的胡椒病根上獲得。取胡椒病根，用蒸餾水清洗表面 土壤后，用解剖針挑取根結(jié)內(nèi)部卵塊，放入裝有0. 5mL無菌水的24孔板中，平均每孔10-15 個(gè)卵塊，28°C靜置孵化；收集孵化的根結(jié)線蟲二齡幼蟲（J2)，于2mL離心管中輕輕混勻后， 制備成線蟲懸液（約3000條/mL)。
[0027]復(fù)篩時(shí)所用根結(jié)線蟲通過盆栽西紅柿保存，種類為南方根結(jié)線蟲（M.incognita)、 花生根結(jié)線蟲（M.arenaria)和爪唾根結(jié)線蟲（M.javanica)，收集方法同上。
[0028] (2)抗線蟲活性菌株的初篩
[0029] 以野外采集的根結(jié)線蟲為供試線蟲，采用24孔板液體浸漬法進(jìn)行抗線蟲活性篩 選。在24孔板中分別加入100μL線蟲懸液、100μL待篩選菌株的發(fā)酵上清液和300μL無 菌水，用移液槍輕輕吹打混勻，每個(gè)待