一種吹打細(xì)胞的裝置及基于其的細(xì)胞傳代培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種吹打細(xì)胞的裝置及基于該裝置的細(xì)胞傳代培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]細(xì)胞傳代培養(yǎng)過程中，影響培養(yǎng)效果的因素除了消化液的選擇、消化液的濃度、消化時間、溫度外，還與細(xì)胞的來源、細(xì)胞的質(zhì)量優(yōu)劣以及傳代過程中消化后的細(xì)胞是否團(tuán)塊狀分布有關(guān)。尤其對于癌變細(xì)胞，基于其自身的特性，傳代培養(yǎng)過程中非常容易呈團(tuán)塊狀貼壁生長。例如PK-15細(xì)胞系來源于E.stlce于1955年11月從一個成年母豬腎培養(yǎng)物建立起來的PK2a細(xì)胞系，M.Harris和H.F.Ruddle 1960年從PK2a的單細(xì)胞克隆中分離得到3個細(xì)胞系，其中一個定名為PK15，當(dāng)時的染色體組型與正常的豬腎細(xì)胞差異不明顯。但隨著不斷的傳代，其染色體已經(jīng)發(fā)生改變，不再保持原來細(xì)胞的二倍體組型，故又稱異倍體細(xì)胞，這種癌變細(xì)胞具有很高的生長和增殖能力，可以無限地傳代。但PK-15細(xì)胞在傳代培養(yǎng)過程中細(xì)胞呈團(tuán)塊狀貼壁生長，分布不均勻，且容易老化，圓縮脫落，不能連續(xù)傳代。例如有報道在培養(yǎng)PK-15細(xì)胞時，使用0.05%的胰蛋白酶消化培養(yǎng)了 48小時的PK-15細(xì)胞后，倒掉胰酶溶液，加入營養(yǎng)液后使用吸耳球吹打，并用力使勁旋轉(zhuǎn)細(xì)胞瓶數(shù)次使細(xì)胞脫落得到細(xì)胞懸液，再將細(xì)胞懸液吸入新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，適度搖晃后再上轉(zhuǎn)瓶機(jī)或置于溫箱中進(jìn)行培養(yǎng)。這種方法培養(yǎng)的細(xì)胞由于細(xì)胞懸液中的細(xì)胞多數(shù)呈團(tuán)塊狀，分布不均勻，在傳代培養(yǎng)的過程中容易老化脫落，不僅導(dǎo)致細(xì)胞損耗較多，還不利于PK-15細(xì)胞的連續(xù)傳代培養(yǎng)。
[0003]消除消化后細(xì)胞的團(tuán)塊狀聚集，使細(xì)胞盡量呈現(xiàn)離散的均勻分布，使細(xì)胞與培養(yǎng)基質(zhì)之間的附著消失是細(xì)胞傳代培養(yǎng)技術(shù)普遍追求的目標(biāo)。中國專利CN202440493U公開了一種新型細(xì)胞傳代裝置，采用吸耳球?qū)ζ康准?xì)胞反復(fù)加壓吹打，使成為單細(xì)胞懸液；中國專利CN202047058U公開了一種傳代細(xì)胞分散、分裝裝置，通過反復(fù)擠壓吸耳球?qū)崿F(xiàn)對細(xì)胞分散分裝的目的?？梢姮F(xiàn)有技術(shù)消除細(xì)胞團(tuán)塊聚集的方式是主要是通過手工方式擠壓吸耳球壓縮空氣吹打細(xì)胞，這些裝置及其應(yīng)用方式僅限于實驗室規(guī)模的細(xì)胞傳代培養(yǎng)，不利于節(jié)省人力物力。因此迫切需要一種新的適于規(guī)模化工廠化的細(xì)胞傳代培養(yǎng)方法，同時克服細(xì)胞團(tuán)塊狀分布的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種適于規(guī)?；S化的細(xì)胞傳代培養(yǎng)方法。
[0005]本發(fā)明的另一目的在于提供一種吹打細(xì)胞的裝置。
[0006]本發(fā)明提供的一種吹打細(xì)胞的裝置，包括第1細(xì)胞瓶和第2細(xì)胞瓶、與2個細(xì)胞瓶分別契合的2個瓶塞、分別與2個瓶塞連接的2個打氣栗；所述瓶塞均縱向貫穿插入3根管，分別為打氣栗管、噴出管、回流管；其中打氣栗管上端與打氣栗相連，噴出管下端連接一個細(xì)針頭，回流管下端連接一個軟管；一個瓶塞的噴出管上端、回流管的上端分別與另一個瓶塞的回流管的上端、噴出管的上端相連。
[0007]在本發(fā)明的一個實施例中，所述的打氣栗管、噴出管、回流管均為不銹鋼管。打氣栗管和回流管內(nèi)徑為10.0mm，噴出管內(nèi)徑為5.0mm ;所述的細(xì)針頭為中空細(xì)針頭，內(nèi)徑為0.1mm ;所述的軟管為硅膠軟管，內(nèi)徑為10.0_。以上各管的規(guī)格參數(shù)可根據(jù)生產(chǎn)實際情況選擇，不局限于本發(fā)明實施例提供的規(guī)格參數(shù)。
[0008]本發(fā)明的吹打細(xì)胞的裝置中，一個瓶塞的噴出管上端、回流管的上端分別與同組的另一個瓶塞的回流管的上端、噴出管的上端通過管道相連通。
[0009]本發(fā)明的吹打細(xì)胞的裝置在應(yīng)用時，起初第1細(xì)胞瓶、第2細(xì)胞瓶中均含有消化后的細(xì)胞和營養(yǎng)液組成的細(xì)胞懸液，開啟第1細(xì)胞瓶的瓶塞打氣栗管連接的打氣栗，細(xì)胞懸液由第1細(xì)胞瓶瓶塞的回流管前端的軟管進(jìn)入，從第2細(xì)胞瓶瓶塞的噴出管前段的細(xì)針頭噴出進(jìn)入第2細(xì)胞瓶；
[0010]關(guān)閉第1細(xì)胞瓶的瓶塞的打氣栗，開啟第2細(xì)胞瓶的瓶塞打氣栗管連接的打氣栗，細(xì)胞懸液由第2細(xì)胞瓶瓶塞的回流管前端的軟管進(jìn)入，從第1細(xì)胞瓶瓶塞的噴出管前段的細(xì)針頭噴出進(jìn)入第1細(xì)胞瓶；
[0011]如此交替開啟2個瓶塞連接的打氣栗，重復(fù)4-6次。
[0012]本發(fā)明提供了上述吹打細(xì)胞裝置在細(xì)胞傳代培養(yǎng)中的應(yīng)用。
[0013]本發(fā)明提供了上述吹打細(xì)胞裝置在生物制品制備中的應(yīng)用。
[0014]本發(fā)明還提供了一種細(xì)胞的傳代培養(yǎng)方法，包括以下步驟:
[0015](1)將細(xì)胞生長良好的細(xì)胞瓶按每兩瓶分為一組，標(biāo)記為第1細(xì)胞瓶、第2細(xì)胞瓶；
[0016](2)每個細(xì)胞瓶中加入消化液消化細(xì)胞；棄去消化液，加入營養(yǎng)液洗下貼壁細(xì)胞得細(xì)胞懸液；
[0017](3)采用本發(fā)明上述的吹打細(xì)胞的裝置吹打細(xì)胞懸液多次；
[0018](4)細(xì)胞懸液吸入營養(yǎng)液瓶中，分裝后培養(yǎng)。
[0019]其中，步驟⑵中加入營養(yǎng)液的量占細(xì)胞瓶總?cè)莘e的2% -12%。本發(fā)明實施例中采用的消化液為胰酶溶液，濃度為0.025 %。
[0020]其中，步驟(3)吹打細(xì)胞懸液的方法為:開啟第1細(xì)胞瓶的瓶塞打氣栗管連接的打氣栗，細(xì)胞懸液由第1細(xì)胞瓶瓶塞的回流管前端的軟管進(jìn)入，從第2細(xì)胞瓶瓶塞的噴出管前段的細(xì)針頭噴出進(jìn)入第2細(xì)胞瓶；
[0021]關(guān)閉第1細(xì)胞瓶瓶塞的打氣栗，開啟第2細(xì)胞瓶瓶塞打氣栗管連接的打氣栗，細(xì)胞懸液由第2細(xì)胞瓶瓶塞的回流管前端的軟管進(jìn)入，從第1細(xì)胞瓶瓶塞的噴出管前段的細(xì)針頭噴出進(jìn)入第1細(xì)胞瓶；
[0022]如此交替開啟2個瓶塞連接的打氣栗，重復(fù)4-6次。優(yōu)選地，重復(fù)5次。
[0023]上述方法中，打氣栗的工作壓力為0.01-0.03MPa，當(dāng)工作壓力為0.02MPa時，效果最好。
[0024]本發(fā)明的實施例中，提供了上述吹打細(xì)胞的裝置在規(guī)?；瘋鞔囵B(yǎng)PK-15細(xì)胞中的應(yīng)用，包括以下步驟:
[0025]使用規(guī)格相同的第1細(xì)胞瓶和第2細(xì)胞瓶培養(yǎng)PK-15細(xì)胞后，加入胰酶消化細(xì)胞；棄去胰酶，加入營養(yǎng)液洗下貼壁細(xì)胞得細(xì)胞懸液，采用上述裝置吹打細(xì)胞懸液，方法為:開啟第1細(xì)胞瓶的瓶塞打氣栗管連接的打氣栗，細(xì)胞懸液由第1細(xì)胞瓶瓶塞的回流管前端的軟管進(jìn)入，從第2細(xì)胞瓶瓶塞的噴出管前段的細(xì)針頭噴出進(jìn)入第2細(xì)胞瓶；
[0026]關(guān)閉第1細(xì)胞瓶的瓶塞的打氣栗，開啟第2細(xì)胞瓶的瓶塞打氣栗管連接的打氣栗，細(xì)胞懸液由第2細(xì)胞瓶瓶塞的回流管前端的軟管進(jìn)入，從第1細(xì)胞瓶瓶塞的噴出管前段的細(xì)針頭噴出進(jìn)入第1細(xì)胞瓶；
[0027]如此交替開啟2個瓶塞連接的打氣栗，重復(fù)4-6次；將吹打后的細(xì)胞懸液吸入營養(yǎng)液瓶中，分裝后培養(yǎng)。
[0028]本發(fā)明方法與現(xiàn)有技術(shù)方法相比，增加了吹打消化后細(xì)胞懸液的步驟，并且通過打氣栗帶動吹打細(xì)胞的裝置，用力均勻，反復(fù)吹打可使細(xì)胞團(tuán)塊減少，細(xì)胞分布均勻，不容易老化脫落，可連續(xù)傳代20-25代，大大節(jié)省了人力，完全滿足工廠化規(guī)模化生產(chǎn)細(xì)胞以及后續(xù)用于制備生物制品的要求。
【附圖說明】
[0029]圖1為本發(fā)明吹打細(xì)胞裝置中的單個瓶塞及其連接部件的剖面圖，其中1為瓶塞，
2、3、4分別為打氣栗管、噴出管、回流管，5為細(xì)針頭，6為硅膠軟管。
[0030]圖2為本發(fā)明吹打細(xì)胞裝置的剖面圖，其中1、9為瓶塞；2、3、4分別為打氣栗管、噴出管、回流管；10、11、12分別為噴出管、回流管、打氣栗管；5、13為細(xì)針頭，6、14為硅膠軟管；7為第1打氣栗、15為第2打氣栗；8、16為第1細(xì)胞瓶和第2細(xì)胞瓶。
[0031]圖3A為未經(jīng)吹打的細(xì)胞懸液顯微鏡下圖片，圖3B為經(jīng)過本發(fā)明吹打細(xì)胞裝置吹打的細(xì)胞懸液顯微鏡下圖片。
[0032]圖4A、圖4C為現(xiàn)有技術(shù)方法(未增加吹打步驟)制備的細(xì)胞懸液培養(yǎng)24h和48h的生長情況，圖4B、圖4D為采用本發(fā)明的吹打細(xì)胞的裝置吹打后的細(xì)胞懸液培養(yǎng)24h和48h的細(xì)胞生長情況。
【具體實施方式】
[0033]以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0034]實施例1本發(fā)明的吹打細(xì)胞裝置的構(gòu)造
[0035]如圖2所示，吹打細(xì)胞的裝置:包括第1細(xì)胞瓶8和第2細(xì)