粉芽抱桿菌Bacillus amyloliquefaciens D2WM對(duì) 油茶主要病害具有明顯的抑制作用。 陽03引 6.液體培養(yǎng)代謝產(chǎn)物抑菌率實(shí)驗(yàn)表明，該解淀粉芽抱桿菌Baci 1 Ius amyloliquefaciens D2WM對(duì)油茶主要病害的抑菌率達(dá)到95% W上。
【附圖說明】
[0034] 圖1為一種解淀粉芽抱桿菌Bacillus amyloliquefaciensD2WM菌落和顯微形態(tài) 示意圖。
[0035] 圖2為一種D2WM與其他菌株的16S rDNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹示意圖。
[0036] 圖3為一種解淀粉芽抱桿菌Bacillus amyloliquefaciensD2WM菌株對(duì)歐文氏菌 的抑菌圈效果圖；
[0037] 圖4為一種解淀粉芽抱桿菌Bacillus amyloliquefaciens D2WM菌株對(duì)油茶主要 病原菌的平板對(duì)時(shí)括抗作用示意圖。
[0038] 圖5為一種抑對(duì)括抗菌發(fā)酵無菌濾液括抗效果的影響示意圖。
[0039] 圖6為一種溫度對(duì)括抗菌發(fā)酵無菌濾液括抗效果的影響示意圖。
[0040]
【附圖說明】：一種解淀粉芽抱桿菌BacillusamyloliquefaciensD2WM菌株在形態(tài) 和培養(yǎng)特征方面：菌體桿狀，周生鞭毛，并具有運(yùn)動(dòng)性；菌落為乳白色，呈近圓形，表面粗糖 有權(quán)皺，邊緣不規(guī)則，不產(chǎn)生可溶性色素。如圖1所示。對(duì)該菌株進(jìn)行分子鑒定，將測(cè)得的 16SrDNA序列（片段長(zhǎng)度為1439bp)與GenBank數(shù)據(jù)庫中序列進(jìn)行BLAST分析，選取9株 菌株用ClustalX2. 1進(jìn)行多序列比對(duì)分析，利用MEGA6.0軟件采用鄰接法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹 構(gòu)建和聚類分析，MEGA6的化i曲bor-化ining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，如圖2所示。結(jié)合上述形 態(tài)和部分生理生化特征，可初步判定括抗菌株D2WM屬于解淀粉芽抱桿菌。采用管碟法考察 解淀粉芽抱桿菌BacillusamyloliquefaciensD2WM20倍稀釋后發(fā)酵液對(duì)歐文氏菌的括 抗作用，其抑菌效果見圖3。結(jié)果表明，該生防菌株對(duì)胡蘿h軟腐歐文氏菌胡蘿h亞種、胡蘿 h軟腐歐文氏菌黑腔亞種和菊歐文氏菌3個(gè)亞種均具有很好的抑菌效果，稀釋10倍后的括 抗菌發(fā)酵液抑菌圈達(dá)到22mmW上。采用平板對(duì)時(shí)培養(yǎng)法研究該解淀粉芽抱桿菌Bacillus amyloliquefaciensD2WM對(duì)多種油茶病原菌的括抗作用，結(jié)果見圖4,該括抗菌對(duì)油茶炭痘 病、葉斑病、黑斑病和潰瘍病均有很好的括抗作用，尤其是對(duì)油茶炭痘病、葉斑病、黑斑病效 果顯著。圖5和6分別為抑和溫度對(duì)括抗菌發(fā)酵無菌濾液括抗效果的影響示意圖。結(jié)果 表明該無菌濾液酸堿耐受范圍很廣，在抑在1-11范圍內(nèi)對(duì)軟腐病原菌均有一定的抑制效 果，并且在抑=9時(shí)，其抑制效果最佳，證明偏堿性的環(huán)境更有利于無菌濾液中的有效成分 發(fā)揮括抗作用。另外，該無菌濾液在2(TC到6(TC范圍內(nèi)保留抑菌活性且在4(TC時(shí)其括抗效 果最佳，當(dāng)溫度高于80°C時(shí)，抑菌活性喪失，說明該無菌濾液中的有效成分不能耐高溫，有 可能是蛋白類的物質(zhì)。
【具體實(shí)施方式】
[0041] 本發(fā)明所用的試劑或原料，均購自商業(yè)渠道。
[0042]菌株來源：歐文氏菌Erwiniacarotovorassp.carotovora、Erwinia chrysanthemi、Erwiniacarotovorassp.Atroseptica，同文南犬中報(bào)道菌株（葛諱珍.魔 芋軟腐病發(fā)病過程動(dòng)態(tài)研究及基于QS系統(tǒng)的防治研究[M]. 2013);油茶膠胞炭痘病Colletotrichum.gloeosporioides，同文獻(xiàn)中報(bào)道菌株（孟慶敏，周國(guó)英，劉君昂，等.油 茶炭痘病括抗細(xì)菌Y13主要抑菌物質(zhì)分離純化及作用方式[J].植物保護(hù)，2014,40(2): 36-42.);油茶炭痘病Colletotrichumnicotianae同文獻(xiàn)中報(bào)道菌株（李東升，張一 揚(yáng).煙草炭痘病的形態(tài)特征和致病性研究[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009(5) :97-98.);油茶 葉斑病^^lostictacapitalensis，同文獻(xiàn)中報(bào)道菌株（馬成，彭麗娟，吳石平.銀 杏葉點(diǎn)霉葉斑病病原菌鑒定[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014, 42(12) :126-128.);油茶軟腐病 Agaricodochiumcamellia,同文獻(xiàn)中報(bào)道菌株（趙丹陽，秦長(zhǎng)生，廖仿炎.5種殺菌劑對(duì) 油茶軟腐病的防治研究[J].廣東林業(yè)科技，2013, 29(2) :28-31.);油茶黑斑病Altermaria alternate同文獻(xiàn)中報(bào)道菌株化obiler!,AkermanMiHubermanLetal.采前與采后處 理結(jié)合控制柿子膽藏過程中鏈格抱菌（Alternariaalternata)引起的黑斑病的研究[J]. 保鮮與加工，2011, 5:025.)，油茶潰瘍病Bothyosphaeriadothidea，同文獻(xiàn)中報(bào)道菌株 (SlippersB,CrousPW,DenmanS,etal.Combinedmultiplegenegenealogiesand phenotypicch曰r曰ctersdifferenti曰tesever曰Ispeciespreviouslyidentified曰s Botryosphaeriadothidea[J].Mycologia, 2004, 96(I) :83-101.) 陽043] 實(shí)施例I:
[0044] 一種解淀粉芽抱桿菌BacillusamyloliquefaciensD2WM的制備方法，其步驟 是： W45] A、芽抱桿菌的分離純化：取健康油茶根際±樣IOg加入到盛有90血無菌水和 30-50顆玻璃珠的S角瓶中，制成1 :10濃度的懸浮液，在28°C，ISOrpm搖床中振蕩30min后，將菌懸液放置在80°C水浴中保持15min。將1mL±壤懸浮液移入盛有9mL無菌水的試 管中，制成10 2菌懸液，依次類推，獲得10 3, 10 4, 10 5?及10 6菌懸液。梯度稀釋后，吸取 100yL稀釋倍數(shù)為10 3-10 6的菌懸液均勻涂布在分離培養(yǎng)基--牛肉膏蛋白腺培養(yǎng)基上， 培養(yǎng)基配方如下（IL):牛肉膏3.Og,蛋白腺10.Og,化Cl5.Og,瓊脂15.Og,蒸饋水1000血， pH7. 2-7. 4。將涂布有菌懸液的平板置于30°C培養(yǎng)箱中1周，24h后隨即觀察分離培養(yǎng)基上 菌落狀態(tài)，用=步劃線發(fā)進(jìn)行分離純化，分離到30株菌株統(tǒng)一編號(hào)登記如下：D1WM、D2WM、 D3WM…D30WM。菌種保藏：接種斜面后，可在4°C短暫保藏。用50% (V/V)甘油（上海振興 化工一廠）作為保護(hù)劑，可在-80°C長(zhǎng)久保藏。
[0046] B、芽抱桿菌的初篩：分別取IOOiiL軟腐病病原菌菌液（約IXIO7C化/ml)均勻 涂布LB平板上，然后用無菌牙簽在每個(gè)平板上點(diǎn)接四個(gè)參試菌株（依次選擇D1WM、D2WM、 D3WM…D30WM中的4個(gè)菌株），每個(gè)處理設(shè)置=個(gè)重復(fù)。在30°CW及37°C恒溫箱中培養(yǎng)24h。 獲得其中對(duì)歐文氏菌有括抗作用的5株菌株D2WM、D9WM、D14WM、D21WM、D29WM。同時(shí)采用 平板對(duì)時(shí)法進(jìn)一步篩選其中能同時(shí)括抗油茶病原菌的括抗細(xì)菌，將打好直徑為7mm的病原 菌餅放置PDA平板中屯、，然后用無菌牙簽薩取待測(cè)菌等距離（距平板中央1.5cm)點(diǎn)接括抗 菌，置于28°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，3天后觀察抑菌帶有無及大小，每個(gè)處理重復(fù)3次，進(jìn)一步篩 選抑菌直徑大于5mm的菌株。通過上述兩步初篩共獲得3株同時(shí)對(duì)軟腐病和油茶主要病害 有括抗效果的菌株D2WM、D9WM、D21WM。
[0047] C、芽抱桿菌的復(fù)篩：將初篩有括抗作用的菌株在LB液體培養(yǎng)基中W15化pm， 30-37°C條件下培養(yǎng)24h，發(fā)酵液W8000巧m離屯、lOmin，上清用0. 22Jim微孔濾膜過濾至滅 菌EP管中。將涂布有IOOiiL病原菌（約IXIO7C化/mL)的LB瓊脂平板上等距離用打孔 器打直徑為7mm的孔。每個(gè)孔中接入50yL發(fā)酵液，W無菌水為對(duì)照，每個(gè)處理設(shè)置=次重 復(fù)。在30°C恒溫箱中培養(yǎng)24h后測(cè)量抑菌圈直徑，根據(jù)數(shù)值大小確定括抗程度。篩選出對(duì) 軟腐病菌菌株有括抗作用的菌株。同時(shí)，分別將初篩括抗菌濾液與約5(TC的PDA固體培養(yǎng) 基按照1:19混勻后倒入培養(yǎng)皿，冷卻至20-25°C后在平板中央放入直徑為7mm的油茶主要 病原菌菌餅，W無菌水為對(duì)照，每個(gè)處理=次重復(fù)。5天后測(cè)量病原菌菌落直徑。篩選出對(duì) 油茶主要病害有括抗作用的菌株。最終篩選得到括抗效果明顯且穩(wěn)定的1株括抗菌解淀粉 芽抱桿菌度acillusamyloliquefaciensD2WM)。
[0048] 通過上述的制備獲得了 一種解淀粉芽抱桿菌Bacillus amyloliquefaciens D2WM，在解淀粉芽抱桿菌Bacillus amyloliquefaciens D2WM中含有SEQ ID NO :1所示的 核巧酸序列。
[0049]該菌株Bacillus amyloliquefaciens D2WM已于2015年10月20日保藏于中國(guó) 典型培養(yǎng)物保藏中屯、（簡(jiǎn)稱CCTCC，湖北省武漢市武昌塔挪山），保藏編號(hào)為M2015623。
[0050] 一種同時(shí)對(duì)蔬菜軟腐病和油茶主要病害具有括抗作用的解淀粉芽抱桿菌 Bacillus amyloliquefaciens D2WM，CCTCC NO :M2015623的鑒定：
[0051]A、一種解淀粉芽抱桿菌BaciIlus amyloliquefaciensD2WM的形態(tài)學(xué)和生理生化 特征：
[0052] 該菌株在形態(tài)和培養(yǎng)特征方面：菌體桿狀，周生鞭毛，并具有運(yùn)動(dòng)性；菌落為乳白 色，呈近圓形，表面粗糖