于擴(kuò)增任何長(zhǎng)度的DNA， 只要DNA在其序列中含有感興趣的選擇的核酸區(qū)域。
[0088] 被選取的選擇的核酸區(qū)域的長(zhǎng)度是足夠長(zhǎng)以提供足以區(qū)分選擇的核酸區(qū)域彼此 的序列信息。通常地，選擇的核酸區(qū)域長(zhǎng)度是至少約16個(gè)核苷酸，并且更通常地，選擇的核 酸區(qū)域長(zhǎng)度是至少約20個(gè)核苷酸。在本發(fā)明的優(yōu)選的方面中，選擇的核酸區(qū)域長(zhǎng)度是至少 約30個(gè)核苷酸。在本發(fā)明的更優(yōu)選的方面中，選擇的核酸區(qū)域長(zhǎng)度是至少約32、40、45、50 或60個(gè)核苷酸。在本發(fā)明的其他方面中，選擇的核酸區(qū)域長(zhǎng)度可以是約100、150或多達(dá) 200 〇
[0089] 在一些方面中，選擇性擴(kuò)增過程利用具有含有與選擇的核酸區(qū)域互補(bǔ)的核酸的引 物對(duì)（即，序列特異性擴(kuò)增過程）的一輪或幾輪擴(kuò)增。在其他方面中，選擇性擴(kuò)增包括初始 的線性擴(kuò)增步驟（同樣是序列特異性擴(kuò)增過程）。如果DNA的初始量是有限的，線性擴(kuò)增方 法可以是特別有用的。線性擴(kuò)增以代表原始DNA含量的方式提高DNA分子的量，這種方式 有助于在例如其中需要選擇的核酸區(qū)域的精確定量的本發(fā)明的情況下降低抽樣誤差。
[0090] 因此，在優(yōu)選的方面中，對(duì)含有無細(xì)胞DNA的起始母體樣品執(zhí)行有限數(shù)目的序列 特異性擴(kuò)增循環(huán)。循環(huán)數(shù)通常地小于用于通常PCR擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)，例如5-30個(gè)循環(huán)或更少。
[0091] 寡核苷酸的組中的寡核苷酸被設(shè)計(jì)以序列特異性的方式與樣品雜交并且擴(kuò)增選 擇的核酸區(qū)域。用于選擇性擴(kuò)增的引物優(yōu)選地被設(shè)計(jì)以1)有效擴(kuò)增來自感興趣的染色體 的選擇的核酸區(qū)域；2)具有從不同母體樣品中的母體和/或胎兒來源的可預(yù)測(cè)范圍的表 達(dá)；以及3)是選擇的核酸區(qū)域特有的，即，不會(huì)擴(kuò)增非選擇的核酸區(qū)域?？梢杂媚┒藰?biāo)簽在 5'端處（例如，用生物素）或沿著引物或探針的其他位置修飾引物或探針，使得擴(kuò)增產(chǎn)物能 夠被純化或附接至固體基質(zhì)（例如，珠或陣列），用于進(jìn)一步的分離或分析。在優(yōu)選的方面 中，引物被工程化以具有例如將在多重反應(yīng)中使用的相容的解鏈溫度，其允許擴(kuò)增許多選 擇的核酸區(qū)域，使得單個(gè)反應(yīng)產(chǎn)生來自不同的選擇的核酸區(qū)域并且優(yōu)選地所有選擇的核酸 區(qū)域的多個(gè)DNA拷貝。然后，來自選擇性擴(kuò)增的擴(kuò)增產(chǎn)物可以用標(biāo)準(zhǔn)PCR方法或用線性擴(kuò) 增被進(jìn)一步擴(kuò)增。
[0092] 無細(xì)胞DNA可以從例如妊娠女性的全血、血漿、或血清中分離，并與被工程化以擴(kuò) 增與感興趣的染色體對(duì)應(yīng)的一組數(shù)目的選擇的核酸區(qū)域的引物孵育。優(yōu)選地，用于Y染色 體特異性序列的初始擴(kuò)增的引物對(duì)的數(shù)目（以及因此Y染色體上選擇的核酸區(qū)域的數(shù)目） 將是8個(gè)或更多，例如16個(gè)或更多、32個(gè)或更多、48個(gè)或更多、或96個(gè)或更多。引物對(duì)的 每一個(gè)與單個(gè)選擇的核酸區(qū)域?qū)?yīng)，并且引物對(duì)任選地被加標(biāo)簽用于鑒定（例如，通過使 用標(biāo)志（indices)或標(biāo)志（indexes))和/或分離（例如，包含用于捕獲的核酸序列或化學(xué) 部分）。執(zhí)行有限數(shù)目的擴(kuò)增循環(huán)，優(yōu)選地10個(gè)或更少。通過本領(lǐng)域中已知的方法任選地 隨后分離擴(kuò)增產(chǎn)物（擴(kuò)增的選擇的核酸區(qū)域）。例如，當(dāng)引物被連接至生物素分子時(shí)，擴(kuò)增 產(chǎn)物可經(jīng)由在固體基質(zhì)上與親和素或鏈霉親和素結(jié)合被分離。然后可使擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)受進(jìn)一 步的生化過程，例如用其他引物（例如，通用引物）的另外擴(kuò)增和/或例如序列確定和雜交 的檢測(cè)技術(shù)。
[0093] 擴(kuò)增的效率在選擇的核酸區(qū)域之間以及在循環(huán)之間可以變化，使得在某些系統(tǒng) 中，歸一化（如以下描述的）可以被用于確保來自選擇的核酸區(qū)域的擴(kuò)增的產(chǎn)物代表樣品 的核酸含量。實(shí)踐本發(fā)明的方法的人們可挖掘關(guān)于擴(kuò)增的產(chǎn)物的相對(duì)頻率的數(shù)據(jù)以確定選 擇的核酸區(qū)域中的變化，包括樣品內(nèi)選擇的核酸區(qū)域中的變化和/或不同樣品中選擇的核 酸區(qū)域（特別是來自不同樣品中相同的選擇的核酸區(qū)域）之間的變化以使數(shù)據(jù)歸一化。
[0094] 作為對(duì)選擇性擴(kuò)增的可替代選擇，選擇的核酸區(qū)域可以通過雜交技術(shù)（例如，捕 獲雜交或與陣列雜交），任選地隨后一輪或更多輪循環(huán)擴(kuò)增來富集。任選地，雜交的或捕獲 的選擇的核酸區(qū)域在擴(kuò)增和序列確定之前被釋放（例如，通過變性）?？梢允褂迷试S選擇 性富集分析中使用的選擇的核酸區(qū)域的多種方法從母體樣品中分離選擇的核酸區(qū)域。分 離可以是移除分析中未使用的母體樣品中的DNA和/或移除初始富集或擴(kuò)增步驟中使用 的任何過量的寡核苷酸。例如，可以使用雜交技術(shù)（富集）從母體樣品分離選擇的核酸區(qū) 域，所述雜交技術(shù)（富集）例如利用將選擇的核酸區(qū)域與固體基質(zhì)例如珠或陣列上的互 補(bǔ)寡核苷酸結(jié)合的捕獲，隨后移除來自樣品的未結(jié)合的核酸。在另一個(gè)實(shí)例中，當(dāng)鎖式探 針（padlock-type probe)技術(shù)被用于選擇性擴(kuò)增（參見，例如Barany等人，美國(guó)專利號(hào) 6, 858, 412和7, 556, 924以及圖7)時(shí)，可以從線性核酸分離環(huán)化的（circularized)核酸產(chǎn) 物，環(huán)化的核酸產(chǎn)物經(jīng)歷選擇性降解。其他有用的分離方法在閱讀本說明書之后對(duì)本領(lǐng)域 技術(shù)人員將是明顯的。
[0095] 選擇的核酸區(qū)域的選擇性擴(kuò)增的拷貝任選地可以在選擇性擴(kuò)增（或富集步驟）之 后，在檢測(cè)步驟之前或者在檢測(cè)步驟期間（即，測(cè)序或其他檢測(cè)技術(shù)）在通用擴(kuò)增步驟中被 擴(kuò)增。在執(zhí)行通用擴(kuò)增時(shí)，添加至選擇性擴(kuò)增步驟中的復(fù)制的選擇的核酸區(qū)域的通用引物 序列用于在單個(gè)通用擴(kuò)增反應(yīng)中進(jìn)一步擴(kuò)增選擇的核酸區(qū)域。如描述的，通過使用用于選 擇性擴(kuò)增步驟的具有通用引物序列的引物，通用引物序列可以在選擇性擴(kuò)增過程（如果執(zhí) 行）期間被添加至復(fù)制的選擇的核酸區(qū)域，使得選擇的核酸區(qū)域的擴(kuò)增的拷貝并入通用引 發(fā)序列。可選地，在擴(kuò)增或富集（如果執(zhí)行）之后，包含通用擴(kuò)增序列的銜接子可以被連接 至選擇的核酸區(qū)域的末端，并且從母體樣品分離選擇的核酸區(qū)域。
[0096] 在DNA擴(kuò)增期間可以向樣品引入偏差和變化性，并且這已知在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR)期間發(fā)生。在其中擴(kuò)增反應(yīng)被多重化的情形中，存在選擇的核酸區(qū)域?qū)⒁圆煌俾驶?效率擴(kuò)增的可能，因?yàn)閷?duì)于給定的選擇的核酸區(qū)域的每一組引物可以基于引物和模板DNA 的堿基組成、緩沖液條件或其他條件而表現(xiàn)不同。用于多重測(cè)定系統(tǒng)的通用DNA擴(kuò)增通常 引入較少的偏差和變化性。另一種最小化擴(kuò)增偏差的技術(shù)包括改變用于不同的選擇的核酸 區(qū)域的引物濃度以限制選擇性擴(kuò)增步驟中序列特異性擴(kuò)增循環(huán)的數(shù)目。在擴(kuò)增步驟中可以 使用相同或不同的條件（例如，聚合酶、緩沖液等）以例如確保偏差和變化性不因?yàn)閷?shí)驗(yàn)條 件而被非故意地引入。
[0097] 在優(yōu)選的方面，執(zhí)行小數(shù)目（例如1-10個(gè)、優(yōu)選地3-5個(gè)）的選擇性擴(kuò)增循環(huán)或 核酸富集，隨后為利用通用引物的通用擴(kuò)增。使用通用引物的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)將是變化的，但將 優(yōu)選地為至少5個(gè)循環(huán)、更優(yōu)選地至少10個(gè)循環(huán)，甚至更優(yōu)選地20個(gè)循環(huán)或更多。一個(gè)或 幾個(gè)選擇性擴(kuò)增循環(huán)之后，通過移至通用擴(kuò)增，具有以比其他的更大的速率擴(kuò)增的某些選 擇的核酸區(qū)域的偏差被減少。
[0098] 任選地，方法包括選擇性擴(kuò)增和通用擴(kuò)增之間的步驟以移除在選擇性擴(kuò)增中非特 異性地?cái)U(kuò)增的任何多余的核酸。來自選擇性擴(kuò)增的整個(gè)產(chǎn)物或產(chǎn)物的等份可被用于通用擴(kuò) 增。
[0099] 在方法中使用的引物的通用區(qū)域被設(shè)計(jì)為與在一個(gè)容器中的一個(gè)反應(yīng)中同時(shí)地 分析大量的核酸的常規(guī)多重化方法是相容的。這樣的"通用的"引發(fā)方法允許有效、高容量 分析存在于母體樣品中的核酸區(qū)域的數(shù)量，并且允許用于確定非整倍性的這樣的母體樣品 內(nèi)核酸區(qū)域的存在的綜合定量。
[0100] 通用擴(kuò)增方法的實(shí)例包括但不局限于用于同時(shí)地?cái)U(kuò)增和/或基因分型多個(gè)樣品 的多重方法，例如在Oliphant等人，美國(guó)專利號(hào)7, 582, 420中描述的那些，其通過引用被并 入本文。
[0101] 在某些方面中，本發(fā)明的測(cè)定系統(tǒng)利用以下組合的選擇性和通用擴(kuò)增技術(shù)之一： (1)與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（"PCR")聯(lián)合的連接酶檢測(cè)反應(yīng)（"LDR") ; (2)與聯(lián)合至LDR的二次 PCR聯(lián)合的初次PCR ;以及（3)與二次PCR聯(lián)合的初次PCR。這些組合中的每一個(gè)對(duì)于最佳 檢測(cè)具有特定效用。但是，這些組合中的每一個(gè)使用多重檢測(cè)，其中來自測(cè)定系統(tǒng)的早期的 寡核苷酸引物包含用于測(cè)定系統(tǒng)的后期的序列。
[0102] Barany 等人，美國(guó)專利號(hào) 6, 852, 487、6, 797, 470、6, 576, 453、6, 534, 293、 6, 506, 594、6, 312, 892、6, 268, 148、6, 054, 564、6, 027, 889、5, 830, 711、5, 494, 810 描述了連 接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（LCR)測(cè)定用于檢測(cè)多個(gè)核酸樣品中的核苷酸的特定序列的用途。Barany 等人，美國(guó)專利號(hào) 7, 807, 431、7, 455, 965、7, 429, 453、7, 364, 858、7, 358, 048、7, 332, 285、 7, 320, 865、7, 312, 039、7, 244, 831、7, 198, 894、7, 166, 434、7, 097, 980、7, 083, 917、 7, 014, 994、6, 949, 370、6, 852, 487、6, 797, 470、6, 576, 453、6, 534, 293、6, 506, 594、 6, 312, 892和6, 268, 148描述了與PCR聯(lián)合的LDR用于核酸檢測(cè)的用途。Barany等人，美 國(guó)專利號(hào)7, 556, 924和6, 858, 412描述了鎖式探針（也稱"環(huán)前探針（precircle probe) " 或"多倒置探針（multi-inversion probes)"）與LDR和PCR聯(lián)合用于核酸檢測(cè)的用途。 Barany等人，美國(guó)專利號(hào)7, 807, 431、7, 709, 201和7, 198, 814描述了組合的核酸內(nèi)切 酶裂解和連接反應(yīng)用于核酸序列的檢測(cè)的用途。Willis等人，美國(guó)專利號(hào)7, 700, 323和 6, 858, 412描述了環(huán)前探針在多重核酸擴(kuò)增、檢測(cè)和基因分型中的用途。Ronaghi等人，美 國(guó)專利號(hào)7, 622, 281描述了用于使用包含獨(dú)特的引物和條形碼的銜接子標(biāo)記和擴(kuò)增核酸 的擴(kuò)增技術(shù)?？捎糜跀U(kuò)增和/或檢測(cè)選擇的核酸區(qū)域的示例性過程包括但不局限于本文描 述的方法，其每一個(gè)通過引用以其整體被并入本文，用于教導(dǎo)可以在本發(fā)明的方法中使用 的多種要素的目的。
[0103] 除了多種擴(kuò)增技術(shù)之外，很多序列確定方法與本發(fā)明的方法是相容的。優(yōu)選地， 這樣的方法包括"下一代"測(cè)序方法。用于序列確定的示例性方法包括但不限于包括但不 限于基于雜交的方法，例如在Drmanac，美國(guó)專利號(hào)6, 864, 052、6, 309, 824、6, 401，267和美 國(guó)公布號(hào)2005/0191656中公開的，其全部通過引用被并入本文；合成測(cè)序方法，例如Nyren 等人，美國(guó)專利號(hào) 7, 648, 824、7, 459, 311 和 6, 210, 891 ;Balasubramanian，美國(guó)專利號(hào) 7, 232, 656 和 6, 833, 246 ;Quake，美國(guó)專利號(hào) 6, 911，345 ;Li 等人，PNAS, 100:414-19(2003); 焦磷酸鹽測(cè)序，如在Ronaghi等人，美國(guó)專利號(hào)7, 648, 824、7, 459, 311、6, 828, 100和 6, 210, 891中描述的；和基于連接的測(cè)序確定方法，例如Drmanac等人，美國(guó)公布號(hào) 2010/0105052 和 Church 等人，美國(guó)公布號(hào) 2007/0207482 和 2009/0018024。
[0104] 可選地，可以利用雜交技術(shù)選擇和/或鑒定選擇的核酸區(qū)域。用于實(shí)施用于檢 測(cè)的多核苷酸雜交測(cè)定的方法已經(jīng)在本領(lǐng)域中良好開發(fā)。雜交測(cè)定程序和條件將取決于 應(yīng)用而不同并且根據(jù)已知的一般結(jié)合方法來選擇，所述一般結(jié)合方法包括在以下中提到的 那些：Maniatis 等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual (第二版 Cold Spring Harbor, N. Y. , 1989) ;Berger 和 Kimmel，Methods in Enzymology,第 152 卷；Guide to Molecular Cloning Techniques (Academic Press,Inc. , San Diego, Calif. , 1987)； 以 及 Young 和 Davis, PNAS, 80:1194(1983)。在例如美國(guó)專利號(hào) 5, 871，928、5, 874, 219、 6, 045, 996、6, 386, 749和6, 391，623中已描述了用于實(shí)施重復(fù)和控制的雜交反應(yīng)的方法和 設(shè)備。
[0105] 在某些優(yōu)選的方面，本發(fā)明還涵蓋了配體之間的雜交的信號(hào)檢測(cè)；參見，美國(guó)專 利號(hào) 5, 143, 854、5, 578, 832、5, 631，734、5, 834, 758、5, 936, 324、5, 981，956、6, 025, 601、 6, 141，096、6, 185, 030、6, 201，639、6, 218, 803 和 6, 225, 625,在 USSN 60/364, 731 中以及在 PCT 申請(qǐng) PCT/US99/06097 (作為 W099/47964 公布）中。
[0106] 用于強(qiáng)度數(shù)據(jù)的信號(hào)檢測(cè)和處理的方法和設(shè)備公開在，例如美國(guó)專利號(hào) 5, 143, 854、5, 547, 839、5, 578, 832、5, 631，734、5, 800, 992、5, 834, 758、5, 856, 092、 5, 902, 723、5, 936, 324、5, 981，956、6, 025, 601、6, 090, 555、6, 141，096、6, 185, 030、 6, 201，639、6, 218, 803 和 6, 225, 625 中，在 USSN 60/364, 731 中以及在 PCT 申請(qǐng) PCT/ US99/06097 (作為 TO99/47964 公布）中。
[0107] 在圖3中，使用包含基本上相同的序列特異性區(qū)域305、307但包含不同標(biāo)志321、 323的兩組固定序列寡核苷酸。用來自相同遺傳樣品300的材料，但在具有不同的等位基因 特異性寡核苷酸組的單獨(dú)的管中實(shí)施連接反應(yīng)。與選擇的核酸區(qū)域313、333中兩個(gè)可能的 SNP對(duì)應(yīng)的橋接寡核苷酸313、333被用于檢測(cè)每一個(gè)連接反應(yīng)中選擇的核酸區(qū)域。指示SNP 的兩個(gè)等位基因標(biāo)志32U323可以被用于鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物，使得感興趣的核酸和SNP的實(shí)際 序列的序列確定不一定是必需的，盡管這些序列可以仍被確定以鑒定和/或提供等位基因 的確證。固定序列寡核苷酸的每一個(gè)包含與選擇的核酸區(qū)域305、307互補(bǔ)的區(qū)域和用于在 初始選擇和/或分離之后擴(kuò)增不同的選擇的核酸區(qū)域的通用引物序列309、311。通用引物 序列位于固定序列寡核苷酸30U303和323的末端并且位于標(biāo)志和與感興趣的核酸互補(bǔ)的 區(qū)域的側(cè)翼，因此將核酸特異性序列和等位基因標(biāo)志保留在擴(kuò)增產(chǎn)物中。在步驟302將固 定序列寡核苷酸301、303、323引入遺傳樣品300的等份并且允許與選擇的核酸區(qū)域315或 325雜交。雜交之后，優(yōu)選地將未雜交的固定序列寡核苷酸從遺傳樣品的剩余物分離（未顯 示）。
[0108] 與A/T SNP 313或G/C SNP 333對(duì)應(yīng)的橋接寡核苷酸在步驟304被引入并且允許 在固定序列寡核苷酸的第一 305和第二307核酸互補(bǔ)區(qū)域之間的選擇的核酸區(qū)域315或 325的區(qū)域中結(jié)合。可選地，可以用固定序列寡核苷酸將橋接寡核苷酸313、333同時(shí)引入樣 品。在步驟306在反應(yīng)混合物中連接結(jié)合的寡核苷酸以產(chǎn)生跨越感興趣的核酸區(qū)域并且與 其互補(bǔ)的連續(xù)的寡核苷酸。
[0109] 連接之后，分離反應(yīng)優(yōu)選地被組合用于通用擴(kuò)增和檢測(cè)步驟。在步驟308將通用 引物317、319引入組合的反應(yīng)以擴(kuò)增連接的寡核苷酸并且在步驟310產(chǎn)生包含代表選擇的 核酸區(qū)域中的SNP的感興趣的核酸區(qū)域的序列的產(chǎn)物327、329。通過測(cè)序產(chǎn)物或產(chǎn)物的部 分，通過鑒定等位基因標(biāo)志、包含來自選擇的核酸區(qū)域的SNP的產(chǎn)物的區(qū)域或二者，檢測(cè)并 定量產(chǎn)物327、329。優(yōu)選地，通過等位基因標(biāo)志的下一代測(cè)序檢測(cè)并且定量圖3的方法的產(chǎn) 物，因此，避免了確定與選擇的核酸區(qū)域互補(bǔ)的產(chǎn)物的區(qū)域或整個(gè)產(chǎn)物的實(shí)際序列的需要。 但是，在其他方面中，可以期望確定標(biāo)志和與選擇的核酸區(qū)域互補(bǔ)的產(chǎn)物的區(qū)域二者的序 列以例如提供結(jié)果的確證。
[0110] 在圖3的方法中（以及在其他圖中闡明的方法中），已經(jīng)描述了等位基因標(biāo)志。但 是，以321和323顯不的標(biāo)志可以是等位基因標(biāo)志、樣品標(biāo)志、組合的等位基因和樣品標(biāo)志、 基因座標(biāo)志或本文描述的或本領(lǐng)域中另外使用的任何其他標(biāo)志或標(biāo)志的組合。
[0111] 此外，在其中有區(qū)別的核苷酸位于固定序列寡核苷酸而不是橋接寡核苷酸的情況 下可采用方法。因此在這樣的示例性測(cè)定系統(tǒng)中，等位基因標(biāo)志與等位基因特異性固定序 列暴核甘酸關(guān)聯(lián)，并且等位基因檢測(cè)由等位基因標(biāo)志的測(cè)序廣生。等位基因標(biāo)志可以肷入 等位基因特異性第一序列寡核苷酸或者第二固定序列寡核苷酸。在特定的方面中，等位基 因標(biāo)志存在于第一和第二固定序列寡核苷酸二者上以檢測(cè)選擇的核酸區(qū)域內(nèi)的兩種或更 多種多態(tài)性。在這樣的方面中使用的固定序列寡核苷酸的數(shù)目可以與待針對(duì)選擇的核酸區(qū) 域評(píng)價(jià)的可能的等位基因的數(shù)目對(duì)應(yīng)，并且等位基因標(biāo)志的序列確定可以檢測(cè)遺傳樣品中 特定等位基因的存在、量或不存在。
[0112] 圖4闡明了本發(fā)明的這方面。在圖4中，使用三種固定序列寡核苷酸40U403和 423。兩種固定序列寡核苷酸401、423是等位基因特異性的，包含與分別含有例如A/T或G/C SNP的核酸區(qū)域中的等位基因互補(bǔ)的區(qū)域。等位基因特異性固定序列寡核苷酸40U423中 的每一個(gè)還包含對(duì)應(yīng)的等位基因標(biāo)志42U431和通用引物序列409。第二固定序列寡核苷 酸403具有第二通用引物序列411，并且這些通用引物序列被用于擴(kuò)增選擇的核酸區(qū)域，以 將寡核苷酸組與來自遺傳樣品的選擇的核酸區(qū)域雜交和連接。通用引物序列位于固定序列 寡核苷酸401、403、423的末端，在標(biāo)志和與感興趣的選擇的核酸區(qū)域互補(bǔ)的固定序列寡核 苷酸中的區(qū)域的側(cè)翼；因此將核酸特異性序列和標(biāo)志捕獲在任何通用擴(kuò)增方法的產(chǎn)物中。
[0113] 在步驟402中，將固定序列寡核苷酸401、403、423引入遺傳樣品400并且允許與 選擇的核酸區(qū)域415、425雜交。雜交之后，優(yōu)選地將未雜交的固定序列寡核苷酸從遺傳樣 品的剩余物分離（未顯示）。橋接寡核苷酸413被引入并且被允許與核酸415在第一等位 基因特異性固定序列寡核苷酸區(qū)域405和另一固定序列寡核苷酸區(qū)域407之間的區(qū)域中雜 交404或與核酸425雜交，與第二等位基因特異性固定序列寡核苷酸區(qū)域4