大豆轉(zhuǎn)化過程中非種系事件的早期檢測和去除的制作方法
【專利說明】
[0001] 優(yōu)先權(quán)要求
[0002] 本申請要求 2013 年 3 月 15 日提交的題為"EARLY DETECTION AND EUMINATI0N OF NON GERM-LINE EVENTS IN THE SOYBEAN TRANSFORMATION PROCESS"的美國臨時專利申 請序列號61/789, 379的申請日的權(quán)益。
[0003] 對電子提交的序列表的援引
[0004] 序列表的正式拷貝作為ASCII格式的序列表通過EFS-Web電子提交，文件名 "70524SEQUENCES"，于2013年3月11日生成，大小為9千字節(jié)，并與本說明書同時提交。在 該ASCII格式文件中包含的序列是說明書的一部分，在此整體并入本申請。
技術(shù)領(lǐng)域
[0005] 本公開部分地涉及從由大豆非種系轉(zhuǎn)化子和大豆種系轉(zhuǎn)化子的組合構(gòu)成的群體 中鑒定大豆種系轉(zhuǎn)化子的方法。相應(yīng)地，大豆非種系轉(zhuǎn)化子在轉(zhuǎn)化過程中被早期檢出并去 除。大豆種系轉(zhuǎn)化子被檢出，并加以選擇以培養(yǎng)成為成熟的大豆植物。該方法易于適用于 在轉(zhuǎn)化過程的早期階段篩選并獲得大豆種系轉(zhuǎn)化子。
[0006] 背景
[0007] 大豆轉(zhuǎn)化方法學(xué)在過去三十年中已經(jīng)得到了發(fā)展和改進。大豆轉(zhuǎn)化方法學(xué)的這 種演進已經(jīng)導(dǎo)致人們能夠成功地將包含農(nóng)藝性狀的轉(zhuǎn)基因?qū)氪蠖够蚪M內(nèi)。1990年代 中期除草劑耐性轉(zhuǎn)基因大豆事件的問世為生產(chǎn)者提供了一種新的、便利的控制廣譜雜草的 技術(shù)革新，這在種植農(nóng)業(yè)方法上是無與倫比的。目前，轉(zhuǎn)基因大豆在全世界都有市售，而且 新的轉(zhuǎn)基因大豆產(chǎn)品，例如Enlist?大豆，為日益嚴(yán)重的雜草問題提供了改進的解決方案。 倘若沒有大豆轉(zhuǎn)化方法學(xué)的開發(fā)和改進，轉(zhuǎn)基因大豆在現(xiàn)代農(nóng)藝實踐中的應(yīng)用是沒有可能 的。開發(fā)出新的、改進的大豆轉(zhuǎn)化方法學(xué)，使之能夠用于檢測并選擇大豆種系，對于應(yīng)對將 新的、復(fù)雜的農(nóng)藝性狀滲入大豆基因組內(nèi)所需的挑戰(zhàn)而言是至關(guān)重要的。
[0008] 在轉(zhuǎn)化過程中及早鑒定并選擇大豆種系轉(zhuǎn)化子是優(yōu)選的，因為大豆種系轉(zhuǎn)化子包 含穩(wěn)定整合的轉(zhuǎn)基因，該轉(zhuǎn)基因能夠在后續(xù)世代中被繼承。由于轉(zhuǎn)化過程是相對低效率的， 所以需要制備大量轉(zhuǎn)化子，以便從不想要的大豆非種系轉(zhuǎn)化子中鑒定并選擇出優(yōu)選的大豆 種系轉(zhuǎn)化子。從轉(zhuǎn)化過程獲得的轉(zhuǎn)化子許多是嵌合的或者是大豆非種系轉(zhuǎn)化子。平均而言， 所有分離的轉(zhuǎn)化子中大約40至70%是大豆非種系轉(zhuǎn)化子。這些大豆非種系轉(zhuǎn)化子是不想 要的，予以剔除。但該剔除過程只有當(dāng)轉(zhuǎn)化子在整個轉(zhuǎn)化過程中被維持、并且達到成熟之后 方可進行。維持不想要的轉(zhuǎn)化子，例如非種系大豆轉(zhuǎn)化子，導(dǎo)致資源的低效利用。在轉(zhuǎn)基因 植物的生產(chǎn)中耗費大量成本。這樣的成本不僅僅在金錢方面的顧慮，還包括科研人員的時 間、器材、和實驗室空間的耗費。
[0009] 開發(fā)并改進能夠用于在大豆轉(zhuǎn)化的起始階段篩選并檢測大豆種系轉(zhuǎn)化子的方法 是非常令人期望的，因為該方法能提高轉(zhuǎn)化過程的效率。
[0010] 前述的相關(guān)技術(shù)的實例以及與之相關(guān)的限定僅意在說明，并無排他性。本領(lǐng)域技 術(shù)人員在閱讀了本說明書后會容易想到相關(guān)技術(shù)的其他限定。
[0011] 公開
[0012] 在一個優(yōu)選的實施方案中，本公開涉及一種用于鑒定大豆種系轉(zhuǎn)化子的方法，包 括下述步驟：用轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化大豆植物組織；從包含該轉(zhuǎn)基因的經(jīng)轉(zhuǎn)化的大豆植物組織再生 芽（shoot);從經(jīng)轉(zhuǎn)化的包含該轉(zhuǎn)基因的大豆植物組織分離該再生芽；使分離的再生芽與 膜接觸，其中含有經(jīng)轉(zhuǎn)化的包含該轉(zhuǎn)基因的大豆植物組織的植物材料從該分離的再生芽被 轉(zhuǎn)移到并固定于該膜；測定該被轉(zhuǎn)移的植物材料以確定所述轉(zhuǎn)基因在該被轉(zhuǎn)移的植物材料 內(nèi)的位置；確定所述分離的再生芽內(nèi)的轉(zhuǎn)基因位置，其中所述轉(zhuǎn)基因位置選自L2/L3組織 層和Ll組織層；并鑒定顯示L2/L3組織層轉(zhuǎn)基因位置的分離再生芽作為大豆種系轉(zhuǎn)化子。
[0013] 在該實施方案的一個進一步的方面，提供了一種從鑒定出的大豆種系轉(zhuǎn)化子再生 成熟轉(zhuǎn)基因大豆植物的方法，包括：選擇包含（comprising)大豆種系轉(zhuǎn)化子的分離的再生 芽；并將該包含大豆種系轉(zhuǎn)化子的分離的再生芽培養(yǎng)成為成熟的轉(zhuǎn)基因大豆植物。
[0014] 在一個進一步的方面，所述的轉(zhuǎn)化采用選自下組的轉(zhuǎn)化方法：土壤桿菌轉(zhuǎn)化、生物 射彈（biolistics)、磷酸|丐轉(zhuǎn)化、聚凝胺（polybrene)轉(zhuǎn)化、原生質(zhì)體融合轉(zhuǎn)化、電穿孔轉(zhuǎn) 化、超聲轉(zhuǎn)化、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)化、顯微注射轉(zhuǎn)化、裸DNA轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化、病毒載體轉(zhuǎn)化、碳化 娃介導(dǎo)轉(zhuǎn)化、氣溶膠聚束（aerosol beaming)轉(zhuǎn)化、或PEG轉(zhuǎn)化。
[0015] 在另一個方面，大豆植物組織選自下組：分生性（meristematic)大豆植物組織、 皮性（dermal)大豆植物組織、基本（ground)大豆植物組織、和維管大豆植物組織。
[0016] 在另一個方面，所述分生性大豆植物組織包括頂端分生組織、初生分生組織、或側(cè) 生分生組織。
[0017] 在另一個方面，所述皮性大豆植物組織包括表皮。
[0018] 在另一個方面，所述皮性大豆植物組織包括周皮。
[0019] 在另一個方面，所述維管大豆植物組織包括木質(zhì)部或韌皮部。
[0020] 在另一個方面，所述轉(zhuǎn)基因包含在至少一個基因表達盒中。
[0021] 在另一個方面，所述基因表達盒包含可選擇標(biāo)志物基因。
[0022] 在另一個方面，所述基因表達盒包含性狀基因。
[0023] 在另一個方面，所述基因表達盒包含RNAi基因。
[0024] 在另一個方面，所述分離包括對所述芽進行橫向水平切割。
[0025] 在另一個方面，所述膜包括硝酸纖維素膜、尼龍膜、聚四氟乙烯膜、或聚偏二氟乙 稀膜。
[0026] 在另一個方面，所述測定包括蛋白質(zhì)檢測測定。
[0027] 在另一個方面，所述蛋白質(zhì)檢測測定包括特異性結(jié)合從所述轉(zhuǎn)基因表達的蛋白質(zhì) 的抗體。
[0028] 在另一個方面，所述確定包括識別固定在所述膜上的被轉(zhuǎn)移的植物材料內(nèi)的點樣 式（dot pattern)〇
[0029] 在另一個方面，所述確定包括識別固定在所述膜上的被轉(zhuǎn)移的植物材料內(nèi)的環(huán)樣 式（ring pattern)〇
[0030] 除了上文所述的示例性方面和實施方案之外，通過研究下面的詳細(xì)說明容易想到 其他方面和實施方案。
[0031] 附圖簡要說明
[0032] 圖1描繪了 pDAB9381的質(zhì)粒圖。
[0033] 圖2,圖面a，展示了從大豆莖切片組織印漬（tissue print)觀察到的環(huán)樣式的 放大的化學(xué)發(fā)光圖像。圖2,圖面b，從大豆莖切片組織印漬觀察到的點樣式的放大的化學(xué) 發(fā)光圖像。圖2,圖面c，用于鑒定大豆莖切片組織印漬（黑點）之位置的經(jīng)處理的硝酸纖 維素膜的落射白光照明圖像。圖2,圖面d，經(jīng)處理的硝酸纖維素膜的化學(xué)發(fā)光圖像。抗體 對PhiYFP的結(jié)合導(dǎo)致產(chǎn)生大豆莖切片組織印漬的化學(xué)發(fā)光信號，該信號被歸類為"環(huán)"或 者"點"圖像樣式。右下角格外明亮的化學(xué)發(fā)光信號為點樣在膜上作為陽性對照的5ng純 化的PhiYFP蛋白。
[0034] 圖3展示了大豆莖切片的共聚焦熒光顯微鏡圖像，這些切片用特異性檢測PhiYFP 蛋白的激發(fā)/發(fā)射參數(shù)加以照明。這些圖像顯示了用于對大豆芽分類的三個類別：圖面a， 無熒光；圖面b，僅表皮細(xì)胞層的熒光；和圖面c，髓和皮層的熒光。
[0035] 圖4是正在發(fā)育的大豆分生組織的示意圖。
[0036] 實施發(fā)明的模式
[0037] I.概覽
[0038] 本發(fā)明公開了一種在植物轉(zhuǎn)化過程的起始階段篩選并檢測大豆種系轉(zhuǎn)化子的方 法。本公開的方法是為了快速鑒定并表征大豆種系轉(zhuǎn)化子而設(shè)計的。簡而言之，通過下述 方式完成對包含轉(zhuǎn)基因的經(jīng)轉(zhuǎn)化大豆植物芽組織的分析：使芽組織與膜接觸，并測定該膜 以確定所述轉(zhuǎn)基因在所述植物材料內(nèi)的位置。在大豆芽的核心（L2和L3)層表達轉(zhuǎn)基因者 被鑒定為大豆種系轉(zhuǎn)化子。圖4顯示了發(fā)育中的大豆分生組織的示意圖。對于鑒定出的大 豆種系轉(zhuǎn)化子進行選擇并培養(yǎng)成為成熟的大豆植物。其他的大豆非種系轉(zhuǎn)化子在早期從轉(zhuǎn) 化過程剔除。這樣，可以分析并篩選大豆種系轉(zhuǎn)化子，以鑒定并選擇具有插入到種系組織內(nèi) 的供體DNA多核苷酸的特定轉(zhuǎn)化子。
[0039] 本文公開的方法相對于先前開發(fā)的用于鑒定和選擇大豆種系轉(zhuǎn)化子的其他已知 方法而言是顯著的改進。參見，美國專利號5, 503, 998、美國專利號5, 830, 728和美國專利 號5, 989, 915。這些先前的方法可以應(yīng)用于利用對實際的莖的組織化學(xué)測定而進行顆粒轟 擊轉(zhuǎn)化和選擇。開發(fā)可以用來篩選利用任何已知的轉(zhuǎn)化規(guī)程產(chǎn)生的種系轉(zhuǎn)化子，且不需要 對經(jīng)轉(zhuǎn)化的大豆組織進行化學(xué)染色的方法是非常令人期望的，因為該方法能提高轉(zhuǎn)化過程 的效率。本申請公開了這樣的方法。
[0040] II 術(shù)語
[0041] 除非有其他定義，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本公開相關(guān)領(lǐng)域的普 通技術(shù)人員所普遍理解的相同的意義。在沖突的情況下，以包括定義在內(nèi)的本申請為準(zhǔn)。除 非上下文要求，否則單數(shù)術(shù)語應(yīng)包括復(fù)數(shù)，復(fù)數(shù)術(shù)語應(yīng)包括單數(shù)。
[0042] 為了進一步明確本公開，提供下述術(shù)語、縮寫和定義。
[0043] 如本文所用，術(shù)語"包含"、"包括"、"具有""含有"，或它們的任何其它變型，都是非 排他性的或者說開放式的。例如，包含一系列元素的組合物、混合物、過程、步驟、方法、制品 或設(shè)備不必僅限于那些元素，而可以包括其它未明確列出的元素，或此類組合物、步驟、方 法、制品或設(shè)備固有的元素。此外，除非有相反的明確說明，"或"是指包含性的"或"，而不 是指排他性的"或"。例如，以下任何一種情況均滿足條件A或B :A為真（或存在）且B為 假（或不存在），A是為真（或不存在）且B是為真（或存在），以及A和B都為真（或存 在）。
[0044] 此外，本公開的實施方案的元素或組分之前的不定冠詞"一"對實例的數(shù)目，即該 元素或組分的出現(xiàn)次數(shù)沒有限制作用。因此"一"應(yīng)該理解為包括至少一，且元素或組分的 單數(shù)單詞形式也包括復(fù)數(shù)，除非數(shù)目顯然應(yīng)是單數(shù)。
[0045] 如本文中使用的術(shù)語"發(fā)明"或"本發(fā)明"是非限制性的術(shù)語，并不意圖指代具體 發(fā)明的任何單一實施方案，而涵蓋申請中公開的所有可能的實施方案。
[0046] 植物：如本文所使用的，術(shù)語"植物"包括整個植物及植物的任何后代、細(xì)胞、組織、 或部分。術(shù)語"植物部分"包括植物的任何部分，包括，例如但不限于：種子（包括成熟種子 和未成熟種子）；植物插條；植物細(xì)胞；植物細(xì)胞培養(yǎng)物；植物器官（如花粉、胚、花、果實、 芽（shoot)、葉、根、莖、和外植體）。植物組織或植物器官可以是種子、原生質(zhì)體、愈傷組織、 或者任何其他被組織成一定結(jié)構(gòu)或功能單元的植物細(xì)胞群。植物細(xì)胞或組織培養(yǎng)物可能能 夠再生出具有該細(xì)胞或組織所來源的植物的生理學(xué)和形態(tài)學(xué)特征的植物，并且可能能夠再 生出與該植物具有基本上相同的基因型的植物。與之相反，一些植物細(xì)胞不能夠再生產(chǎn)生 植物。植物細(xì)胞或組織培養(yǎng)物中的可再生細(xì)胞可以是胚、原生質(zhì)體、分生組織細(xì)胞、愈傷組 織、花粉、葉、花藥、根、根尖、須、花、果仁、穗、穗軸、殼、或莖。
[0047] 植物部分包括可收獲的部分和可用于繁殖后代植物的部分?？捎糜诜敝车闹参锊?分包括，例如但不限于：種子；果實；插條；苗；塊莖；和根砧木。植物的可收獲部分可以是 植物的任何有用部分，包括，例如但不限于：花；花粉；苗；塊莖；葉；莖；果實；種子；和根。
[0048] 植物細(xì)胞是植物的結(jié)構(gòu)和生理的單位，包括原生質(zhì)體和細(xì)胞壁。植物細(xì)胞可以是 分離的單細(xì)胞或細(xì)胞聚集體的形式（例如，松散型（friable)愈傷組織和培養(yǎng)細(xì)胞），并且 可以是更高級有組織單元的一部分（例如，植物組織、植物器官、和植物）。因此，植物細(xì)胞 可以是原生質(zhì)體、配子產(chǎn)生細(xì)胞、或可以再生成完整植物的細(xì)胞或細(xì)胞集合。因此，種子，因 其包括多個植物細(xì)胞并能夠再生為完整植物，在本文的實施方案中被認(rèn)為是一種"植物細(xì) 胞"。
[0049] 分離的："分離的"生物組分（例如，核酸或多肽）已經(jīng)與該組分天然存在的生物 細(xì)胞中的其它生物組分（即，其它染色體或染色體外DNA和RNA，和蛋白）實質(zhì)上分離、與 之分別產(chǎn)生、或從之純化出來，在分離、產(chǎn)生和純化的同時實現(xiàn)了該組分的化學(xué)或功能變化 (例如核酸可以通過斷裂連接該核酸與染色體中其余DNA的化學(xué)鍵而從染色體分離）。已 經(jīng)"分離的"核酸分子和蛋白包括通過標(biāo)準(zhǔn)純化方法純化的核酸分子和蛋白。該術(shù)語還包括 通過在宿主細(xì)胞內(nèi)重組表達制備的核酸分子和蛋白，以及化學(xué)合成的核酸分子、蛋白和肽。
[0050] 核酸：術(shù)語"多核苷酸"、"核酸"和"核酸分子"在本文中可以互換使用，并包括單 個核酸、多個核酸、核酸片段、變體或其衍生物、和核酸構(gòu)建體（例如信使RNA (mRNA)和質(zhì)粒 DNA (pDNA))。多核苷酸或核酸可以含有全長cDNA序列、或其片段的核苷酸序列，包括非翻 譯的5'和/或3'序列和編碼序列。多核苷酸或核酸可以由任何多聚核糖核苷酸或多聚脫 氧核糖核苷酸構(gòu)成，其可以包括未修飾的核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸或修飾的核糖核苷 酸或脫氧核糖核苷酸。例如，多核苷酸或核酸可以包括單鏈、雙鏈DNA ;單鏈區(qū)和雙鏈區(qū)混 合物DNA ;單鏈和雙鏈RNA ;單鏈區(qū)和雙鏈區(qū)混合物RNA。包含DNA和RNA的雜交分子可以 是單、雙鏈、或單鏈區(qū)和雙鏈區(qū)的混合物。前述術(shù)語還包括化學(xué)、酶學(xué)和代謝修飾形式的多 核苷酸或核酸。
[0051] 應(yīng)當(dāng)理解，具體的DNA還指其互補物，其序列根據(jù)脫氧核糖核苷酸堿基配對的規(guī) 則確定。
[0052] 如本文所使用的，術(shù)語"基因"是指編碼功能產(chǎn)物（RNA或多肽/蛋白）的核酸?；?因可以包含位于編碼功能產(chǎn)物的序列之前（5'非編碼序列）和/或之后（3'非編碼序列） 的調(diào)節(jié)序列。
[0053] 如本文所使用的，術(shù)語"編碼序列"是指編碼特定氨基酸序列的核酸序列。"調(diào)節(jié) 序列"是指位于編碼序列上游（例如，5'非編碼序列）、內(nèi)部或下游（例如，3'非編碼序列） 的核苷酸序列，其影響相關(guān)編碼序列的轉(zhuǎn)錄、RNA加工或穩(wěn)定性、或翻譯。調(diào)節(jié)序列包括，例 如但不限于：啟動子；翻譯前導(dǎo)序列；內(nèi)含子；多腺苷酸化識別序列；RNA加工位點；效應(yīng)物 結(jié)合位點；和莖環(huán)結(jié)構(gòu)。
[0054] 雜交：包含全部或部分核苷酸序列的核酸可以用作探針，與克隆的基因組DNA片 段或cDNA片段（例如，來自所選生物的基因組或cDNA文庫）群體中存在的、與探針序列具 有顯著量的序列同一性的核苷酸序列選擇性"雜交"。雜交探針可以是基因組DNA片段、質(zhì) 粒DNA片段、cDNA片段、RNA片段、PCR擴增的DNA片段、寡核苷酸、或其他多聚核苷酸，并 且探針可以用可檢測的基團（例如32P)或任何其他可檢測的標(biāo)記標(biāo)記。因此，例如但不限 于，用于雜交的探針可以通過標(biāo)記可特異性雜交本文中的核酸（例如與SEQ ID N0:1具有 至少大約90%同一性的核酸）的人造寡核苷酸加以制備。用于制備雜交探針和用于構(gòu)建 cDNA和基因組文庫的方法是本領(lǐng)域已知的。Sambrook等人.（1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, NY。關(guān)于核酸雜交的詳盡指導(dǎo)可以參見Sambrook等人（1989)，同上；和 Ausubel 等人（1997) Short Protocols in Molecular BiologyjThird Edition, Wiley, NY, New York,pp.2-40〇
[0055] 如本文所使用的，術(shù)語"多肽"包括單個多肽、多個多肽、和其片段。該術(shù)語是指由 通過酰胺鍵（也稱作肽鍵）線性連接的單體（氨基酸）構(gòu)成的分子。術(shù)語"多肽"是指兩個 或多個氨基酸構(gòu)成的任何鏈，且不指示產(chǎn)物的具體長度和大小。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、 蛋白質(zhì)、氨基酸鏈、和任何其它用于指示有兩個或多個氨基酸的鏈的術(shù)語均包含在"多肽" 的定義之內(nèi)，并且前述術(shù)語在本文中可以和"多肽"互換使用。多肽可以是從天然生物源分 離的或者通過重組技術(shù)產(chǎn)生的，但是具體的多肽不一定是從特定的核酸翻譯產(chǎn)生的。多肽 可以用任何合適的方式產(chǎn)生，包括例如但不限于，通過化學(xué)合成。
[0056] 內(nèi)源的和異源的：如本文所使用的，術(shù)語"天然的"是指在自然界中發(fā)現(xiàn)的、并與其 自身的調(diào)節(jié)序列（如果存在的話）在一起的多核苷酸、基因或多肽形式。術(shù)語"內(nèi)源的"是 指處于生物或生物基因組中的天然位置處的多核苷酸、基因或多肽的天然形式。
[0057] 相反，術(shù)語"異源的"是指在參考（宿主）生物的位置處通常不會發(fā)現(xiàn)的多核苷酸、 基因或多肽。例如，異源核酸可以是通常在參考生物的不同基因組位置處被發(fā)現(xiàn)的核酸。作 為進一步的實例，異源核酸可以是通常不會在參考生物中被發(fā)現(xiàn)的核酸。含有異源多核苷 酸、基因或多肽的宿主生物可以通過將異源多核苷酸、基因或多肽導(dǎo)入到宿主生物內(nèi)而產(chǎn) 生。在特定的實例中，異源多核苷酸包括以不同于相應(yīng)的天然多核苷酸的形式被重新導(dǎo)入 到來源生物內(nèi)的天然編碼序列、或其部分。在特定的實例中，異源基因包括以不同于相應(yīng)的 天然基因的形式被重新導(dǎo)入到來源生物內(nèi)的天然編碼序列或其部分。例如，異源基因可以 包括天然編碼序列，該天然編碼序列是含有非天然調(diào)節(jié)區(qū)的嵌合基因的一部分，該嵌合基 因被重新導(dǎo)入到天然宿主內(nèi)。在特定的實例中，異源多肽是以不同于相應(yīng)的天然多肽的形 式被重新導(dǎo)入到來源生物內(nèi)的天然多肽。
[0058] 異源基因或多肽可以是這樣的基因或多肽，其包含功能性多肽或編碼功能性多肽 的核酸序列，該功能性多肽或編碼功能性多肽的核酸序列與其它基因或多肽融合從而產(chǎn)生 嵌合或融合的多肽或編碼它的基因?；蚝偷鞍椎奶囟▽嵤┓桨赴ň唧w例舉的全長序列 和部分、區(qū)段、片段（包括與全長分子相比具有內(nèi)部和/或末端缺失的連續(xù)片段）、變體、突 變體、嵌合體、以及這些序列的融合。
[0059] 修飾：如本文所使用的，術(shù)語"修飾"可以指特定參考多核苷酸內(nèi)的改變，其導(dǎo)致 由該參考多核苷酸編碼的多肽的活性降低、基本上消失、或消失。修飾還指參考多肽中的 改變，其導(dǎo)致參考多肽的活性減低、基本上消失、或消失?；蛘撸g(shù)語"修飾"可以指參考多 核苷酸中的改變，其導(dǎo)致該參考多核苷酸編碼的多肽的活性增加或提高，以及參考多肽中 的改變，其導(dǎo)致參考多肽的活性增加或提高。諸如前述的改變可以通過任何本領(lǐng)域眾所周 知的方法實現(xiàn)，這樣的方法有若干種，包括，例如但不限于：缺失參考分子的一部分；突變 參考分子（例如通過自發(fā)誘變；通過隨機誘變；通過增變基因?qū)е碌恼T變；和通過轉(zhuǎn)座子誘 變）；取代參考分子的一部分；在參考分子內(nèi)插入元件；下調(diào)參考分子的表達；改變參考分 子的細(xì)胞定位；改變參考分子的狀態(tài)（例如通過參考多核苷酸的甲基化，和通過參考多肽 的磷酸化或泛素化）；除去參考分子的輔助因子；導(dǎo)入靶向參考分子的反義RNA/DNA ;導(dǎo)入 靶向參考分子的干擾RNA/DNA ;參考分子的化學(xué)修飾；參考分子的共價修飾；用UV輻射或 X射線輻照參考分子；改變參考分子的同源重組；改變參考分子的有絲分裂重組；代替參考 分子的啟動子；和/或前述的任意組合。
[0060] 可以通過比較參考多核苷酸或多肽的序列與同源（例如同源酵母或細(xì)菌）多核苷 酸或多肽的序列，并使高度同源區(qū)（保守區(qū)）或共有序列中的修飾數(shù)目最大化，來找到確定 在具體實例中哪些核苷酸或氨基酸殘基可以被修飾的指引。
[0061] 啟動子：術(shù)語"啟動子"指一種能夠控制核酸編碼序列或功能RNA的表達的DNA序 列。在實例中，受控制的編碼序列位于啟動子序列的3'?？梢詮奶烊换蛑姓w獲得啟動 子，啟動子可以包括來自天然出現(xiàn)的不同啟動子的不同元件，或者啟動子甚至可以包括人 造的DNA片段。本領(lǐng)域的技術(shù)人員理解，不同的啟動子可以指導(dǎo)基因在不同組織或細(xì)胞類 型中，或者在不同的發(fā)育階段，或者響應(yīng)不同的環(huán)境或生理條件表達。所有上述啟動子的實 例都是已知的，并且在本領(lǐng)域中用于控制異源核酸的表達。指導(dǎo)基因在大多數(shù)細(xì)胞類型中 在大部分時間里表達的啟動子通常稱為"組成型啟動子"。此外，雖然本領(lǐng)域技術(shù)人員已經(jīng) 嘗試界定調(diào)節(jié)序列的確切邊界（在許多情況下未成功），但是已經(jīng)認(rèn)識到，長度不同的DNA 片段可能具有相同的啟動子活性。特定核酸的啟動子活性可以使用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)進行 測定。
[0062] 可操作連接：術(shù)語"可操作連接"是指單一核酸上的多個核酸序列的關(guān)聯(lián)，其中