一種異養(yǎng)硝化耐鹽菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物環(huán)保技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種異養(yǎng)硝化耐鹽菌及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 中國目前有行政村60多萬個，村莊人口有7. 6億，其中96%村莊缺乏污水處理系 統(tǒng)。農(nóng)村污水基數(shù)大，但受農(nóng)村經(jīng)濟發(fā)展水平，生產(chǎn)、生活方式等發(fā)展水平影響，不同地區(qū)農(nóng) 村的污水排放特征差別很大。目前城鎮(zhèn)污水處理廠采用的技術(shù)和運行模式不適合用于農(nóng)村 分散型污水的處理。隨著國家對農(nóng)村開發(fā)力度加大，諸如農(nóng)家樂、村辦企業(yè)和養(yǎng)殖企業(yè)等不 斷增多，農(nóng)村污水類型不斷增加，污水中含鹽量、氮憐等含量不斷升高，加之化肥和農(nóng)藥的 使用，運增加了污水治理難度。污水無序排放造成地表水、地下水的污染，水庫、池塘和河道 等水體變黑，富營養(yǎng)化嚴重，惡臭污染大氣，嚴重影響居住環(huán)境和身屯、健康。加之，農(nóng)村地區(qū) 經(jīng)濟較為落后，高耗能、較高費用的技術(shù)很難推廣應(yīng)用。當(dāng)前，必需尋找一種成本較低、無二 次污染、應(yīng)用范圍廣和適應(yīng)性強的技術(shù)，且適合在中國農(nóng)村地區(qū)推廣應(yīng)用。
[0003] 隨著我國農(nóng)村經(jīng)濟的高速發(fā)展，特別是第=產(chǎn)業(yè)的大量引進，污水的類型也在不 斷增加，其中含鹽廢水分布最為廣泛，特別餐飲廢水，嚴重制約著脫氮菌的脫氮除污效果。 因此，人們對于可W進行農(nóng)村污水處理的菌類仍存在需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種異養(yǎng)硝化耐鹽菌及其應(yīng)用。所述異養(yǎng)硝化耐鹽菌是從湖 北十堪農(nóng)村生活污水中分離篩選得到的，該菌可W應(yīng)用在污水處理中。 陽0化]本發(fā)明提供的異養(yǎng)硝化耐鹽菌，該菌命名為Hy化OgenophagapseudoflavaSP.C2,屬于類黃色食氨產(chǎn)水菌，于2015年6月10日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員 會普通微生物中屯、（簡稱CGMCC;地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微 生物研究所），保藏編號為：CGMCCNo. 10977。
[0006] 優(yōu)選地，所述異養(yǎng)硝化耐鹽菌菌株的16SrDNA序列如序列表1所示，其長度為 1372bp〇
[0007] 優(yōu)選地，所述異養(yǎng)硝化耐鹽菌菌株具有W下表型特征：在30~37°C下，瓊脂培養(yǎng) 基上培養(yǎng)24~7化后，菌落表面變光滑，淡黃色；菌體細桿狀，0. 3X0. 6ym~1. 5ym，單 個、成對排列，芽抱中生，楠圓形，抱囊膨大，革蘭氏陰性。
[0008] 根據(jù)所述異養(yǎng)硝化耐鹽菌的形態(tài)特征和生理生化特征及其16SrDNA在Genbank 中的檢索結(jié)果，并繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，綜合鑒定該菌株為類黃色食氨產(chǎn)水菌（命名為 Hydrogenophagapseudoflavasp.C2)。
[0009] 優(yōu)選地，所述異養(yǎng)硝化耐鹽菌菌株的耐鹽度（W化Cl計）為1%~10重量％，更 優(yōu)選地1 %~3重量％。
[0010] 優(yōu)選地，所述異養(yǎng)硝化耐鹽菌菌株的去除氨氮效果為起始氨氮濃度小于200mg/l， 更優(yōu)選地為0~lOOmg/L。
[0011] 本發(fā)明提供上述異養(yǎng)硝化耐鹽菌在污水凈化中的應(yīng)用。 陽〇1引所述污水的含鹽量（W化Cl計）為1%~10重量％，起始氨氮濃度小于200mg/ L。
[0013] 優(yōu)選地，所述污水的含鹽量（W化Cl計）為1 %~3重量％，起始氨氮濃度為0~ lOOmg/Lo
[0014] 特別地，所述污水為農(nóng)村生活污水。
[0015] 本發(fā)明的異養(yǎng)硝化耐鹽菌（Hy化Ogenophagapseudoflavasp.C2,類黃色食氨產(chǎn) 水菌）與現(xiàn)有技術(shù)比較有如下有益效果：
[0016] (1)本發(fā)明的異養(yǎng)硝化耐鹽菌菌株在好氧條件下，含鹽量高的條件下，W氨氮為唯 一氮源，進行異養(yǎng)硝化作用。利用該菌株的運種特性，可將其直接應(yīng)用于含鹽量高的農(nóng)村生 活污水中，例如廚余污水等中，可實現(xiàn)在含鹽量高的污水中對氮的去除。由此，其應(yīng)用前景 和社會效益較好。
[0017] (2)本發(fā)明的異養(yǎng)硝化耐鹽菌菌株的耐鹽度（W化Cl計）為1%~10重量％，在 鹽度1 %~3重量％的范圍均能生長且高效脫氮。
[0018] (3)本發(fā)明的異養(yǎng)硝化耐鹽菌菌株在起始氨氮濃度小于200mg/L的范圍均可發(fā)揮 脫氮功能，在0~lOOmg/L脫氮率較高。
[0019] 本發(fā)明的異養(yǎng)硝化耐鹽菌為篩選自含鹽量高的農(nóng)村生活污水中的±著微生物，將 其用于含鹽量高的農(nóng)村生活污水中，其經(jīng)濟效益可觀，將會大大節(jié)約污水處理成本，也不需 要考慮菌種的安全性，適合在我國聚集地較為分散的農(nóng)村地區(qū)使用。本發(fā)明異養(yǎng)硝化耐鹽 菌菌株有較好的脫氮效果，通過投加該菌，可有效提高±著微生物對含鹽量高的農(nóng)村生活 污水中氮及CODcr的去除效率。
【附圖說明】
[0020] 圖1為本發(fā)明異養(yǎng)硝化耐鹽菌（Hy化Ogenophagapseudoflavasp.C2)菌株菌體 形態(tài)電鏡照片。
[0021] 圖2為本發(fā)明異養(yǎng)硝化耐鹽菌（Hy化Ogenophagapseudoflavasp.C2)菌株菌落 形態(tài)照片。
[0022] 圖3為本發(fā)明異養(yǎng)硝化耐鹽菌（Hy化Ogenophagapseudoflavasp.C2)菌株與相 關(guān)種的16SrDNA序列發(fā)育樹。
[0023] 圖4為本發(fā)明異養(yǎng)硝化耐鹽菌（Hy化Ogenophagapseudoflavasp.C2)菌株的生 長曲線。
[0024] 圖5為本發(fā)明異養(yǎng)硝化耐鹽菌（Hy化Ogenophagapseudoflavasp.C2)菌株在不 同起始氨氮濃度下的脫氮效果。
[00巧]圖6為本發(fā)明異養(yǎng)硝化耐鹽菌（Hy化Ogenophagapseudoflavasp.C2)菌株在不 同鹽濃度下脫氮效果。
【具體實施方式】
[0026] 實施例1本發(fā)明菌株的分離鑒定：
[0027] (1)培養(yǎng)基：
[0028] ①脫氮培養(yǎng)基：硫酸錠0. 48g，班巧酸4. 71g，微量元素溶液50mU溶解后用蒸饋水 定容至比，抑控制在7.0~7.2。（固體培養(yǎng)基，加入2%瓊脂）
[0029] 所述微量元素溶液：K2HPO4? 3&06. 5g，M拆〇4? 7&0 2. 5g，化Cl2. 5g，F(xiàn)eS〇4? 7&0 0. 05g，MnS〇4 ? &0 0. 04g，溶解后用蒸饋水定容至IL;
[0030] ②耐鹽培養(yǎng)基：5g/L酵母浸膏粉，lOg/L膜蛋白腺，50g/L化Cl,pH7.0~7. 5;
[0031] (2)脫氮菌株的分離篩選
[0032] 用無菌移液管取10血湖北十堪農(nóng)村生活污水，置于容量為250血的S角瓶（其中 含有IOOmL無菌脫氮培養(yǎng)基）中，搖床富集培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為30°C，轉(zhuǎn)速16化pm，每一代培 養(yǎng)=天。采用二苯胺試劑檢測硝酸菌的存在。富集培養(yǎng)菌液直至培養(yǎng)基中出現(xiàn)硝酸菌。
[0033] 采用極限稀釋的方法將含有硝酸菌的培養(yǎng)液進行平板涂布，37°C恒溫培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)4化后，選取單一菌落進行多次平板分區(qū)劃線。在顯微鏡下觀察無雜菌時，菌株純化結(jié) 束。
[0034] 將純化好的菌株進行氨氮去除篩選實驗，將菌株分別接種至耐鹽培養(yǎng)基中，37°C 恒溫培養(yǎng)相中培養(yǎng)4化后，測定氨氮去除率，選取氨氮去除率高于85%的菌株作為選到的 脫氮菌。
[0035] (3)脫氮耐鹽菌株的篩選
[0036] 將篩選到的脫氮菌株分別進行極限稀釋和平板涂布于耐鹽培養(yǎng)基上。能在耐鹽培 養(yǎng)基上生長良好的菌株為脫氮耐鹽菌。
[0037] (4)篩選到一株脫氮耐鹽菌，特征為：在30~37°C下，瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)24~ 7化后，菌落表面變光滑，淡黃色；在革蘭氏染色后在顯微鏡下呈陰性，菌體呈細桿狀， 0.3X0.6ym~1.5ym，單個、成對排列，芽抱中生，楠圓形，抱囊膨大。具體見圖1和圖2。 圖1為本發(fā)明異養(yǎng)硝化耐鹽菌菌株菌體形態(tài)電鏡照片。圖2為本發(fā)明異養(yǎng)硝化耐鹽菌菌株 菌落形態(tài)照片。
[0038] (5) 16SrDNA序列分析與系統(tǒng)發(fā)育分析
[0039] 通過16SrDNA的PCR擴增與測序，得到16SrDNA基因序列長度為1372bp(見后面 的序列表1)。提交Genbank進行比對，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明異養(yǎng)硝化耐鹽菌C2與Hy化Ogenophaga pseudoflava同源性可達到99%。采用MEGA5. 0軟件，鄰位連接法顯示該菌株與相關(guān)種的 16SrDNA序列發(fā)育樹，進行1000次的相似度重復(fù)計算，圖中發(fā)育樹節(jié)點只顯示Bootstrap 值大于50%數(shù)值（見圖3。圖3為本發(fā)明異養(yǎng)硝化耐鹽菌菌株與相關(guān)種的16SrDNA序 列發(fā)育樹）。命名該菌株為Hy化OgenophagapseudoflavaSP.C2,并于2015年6月10日 保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、（簡稱CGMCC)，保藏號為CGMCC No.10977。 W40] 實施例2生長曲線測定實驗
[0041]取18支無菌大試管，用記號筆分別標明培養(yǎng)時間，即0、2、4、6、8、10、12、14、16、 18、20、22、24、26、28、30、32 和:3地。 W42] 用無菌管吸取2. 5血實施例1中得到的異養(yǎng)硝化耐鹽菌Hy化Ogenophaga pseudoflavasp.C2培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入盛有250mL脫氮培養(yǎng)基的立角瓶中，混合均勻后分別取SmL混合液轉(zhuǎn)入上述標記的18支無菌大試管中。將已接種的試管置搖床37°C震蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速 160巧111，分別培養(yǎng)0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32和3地。將標有相應(yīng) 時間的試管取出，立即放入冰箱，待測。用未接種的脫氮培養(yǎng)液做空白對照，樣品測定前，將 培養(yǎng)液充分振蕩，使細胞均勻分布。選用600nm波長進行光電比濁測定。具體測定結(jié)果見 圖4。圖4為本發(fā)明異養(yǎng)硝化耐鹽菌（Hy化Ogenophagapseudoflavasp.C2)菌株的生長曲 線。
[0043]由圖4可W看出，本發(fā)明異養(yǎng)硝化耐鹽菌（Hy化Ogenophaga pseudoflava sp.C2) 生長良好，0~地處于菌株的適應(yīng)期，5~2化進入對數(shù)生長，27~3化為菌株的穩(wěn)定期， 3化后進入衰亡期。 W44] 實施例3耐鹽度測定試驗
[0045] 采用稀釋涂布的方法，將活化好的本發(fā)明異養(yǎng)硝化耐鹽菌（Hy化Ogenophaga pseudo