術(shù)研究中心，已保藏于中國(guó)科學(xué)院淡水藻種庫(kù)，保藏號(hào)為FACHB-1768。培養(yǎng)15天以后微藻達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末期，此時(shí)微藻的生物質(zhì)濃度達(dá)到最高為1.07?1.llg/L，油脂含量為23.4%?25.6%。然后將對(duì)數(shù)期末期的四尾柵藻放置于高溫40°C的環(huán)境中進(jìn)行脅迫培養(yǎng)，保持光照強(qiáng)度為60001ux連續(xù)培養(yǎng)6天。在6天的脅迫培養(yǎng)過(guò)程中，每天將微藻在4000r/min，4°C條件下進(jìn)行離心收獲，并檢測(cè)其生物質(zhì)濃度和油脂含量的變化。生物質(zhì)濃度和油脂含量變化分別如圖1和2所不。
[0028]在培養(yǎng)I天后獲得油脂含量(占干重的百分?jǐn)?shù))最高的微藻，為32.6%?34.5%，提高了約40%。隨著高溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，四尾柵藻的油脂含量不斷下降，到第6天時(shí)得到的油脂含量為20.5%?21.9%，說(shuō)明過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的高溫脅迫不利于微藻積累油脂。而空白對(duì)照組，即沒有經(jīng)過(guò)高溫脅迫的微藻培養(yǎng)6天后油脂含量為22.8%?26.2%，相比對(duì)數(shù)期末期沒有明顯升高，說(shuō)明通過(guò)微藻自身在穩(wěn)定期生長(zhǎng)進(jìn)行油脂積累效率較低。如圖1所示，在I天的脅迫培養(yǎng)過(guò)程中，四尾柵藻的生物質(zhì)濃度沒有受到影響，但隨著脅迫培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)至6天，微藻生物質(zhì)濃度開始緩慢下降，顯示出長(zhǎng)時(shí)間處于高溫環(huán)境中會(huì)導(dǎo)致微藻細(xì)胞死亡。
[0029]上述實(shí)施例中測(cè)定微藻油脂含量的方法如下:
[0030]利用離心機(jī)將藻液于4000r/min，4°C下離心收獲，獲得的藻泥在冰箱內(nèi)冷凍成塊，然后用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行冷凍干燥，將干燥后的微藻在研缽中磨成粉末，并放入烘箱中烘干后保存待用。
[0031]1.稱取約0.1g干藻粉(Hi1)于50ml離心管中，加入1ml氯仿/甲醇(2:1)溶液，用超聲波細(xì)胞破碎儀破碎(處理)1min(頻率為20% );
[0032]2.將混合物在4000r/min下離心lOmin，離心結(jié)束后混合物分兩相，將上清液轉(zhuǎn)移到60mL的分液漏斗中，再往離心管中加入1ml氯仿/甲醇(2:1)溶液，并利用超聲和離心按步驟1、2重復(fù)整個(gè)提取過(guò)程；
[0033]3.根據(jù)油脂提取液體積，投加0.9%的氯化鈉溶液(加入氯化鈉溶液體積為油脂提取液體積的1/5，約3?4mL氯化鈉溶液)，充分搖勾Imin,并靜置15min待液體分層；
[0034]4.測(cè)量低相溶液體積V，并取5mL低相溶液于1mL玻璃試管(m。)中，用氮?dú)獯蹈桑瑢⒉ＡЧ芊胖糜?0°C烘箱中烘至恒重(m2，約30分鐘)。
[0035]油脂含量:Lff(%) = (Hi2Ii1) XVX 100/(5X110 ；
[0036]式中:LW—基于干重下的油脂含量％，g/g ;
[0037]Iii1一藻粉干重，g ；
[0038]m2—帶有油脂的1mL玻璃管干重，g ；
[0039]m0—1mL 玻璃管干重，g ；
[0040]V一低相油脂的體積，mL。
[0041]最終實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，本發(fā)明所提供的利用高溫脅迫促進(jìn)對(duì)數(shù)期末期的四尾柵藻積累油脂的方法，可實(shí)現(xiàn)油脂在I天內(nèi)快速積累，使油脂含量顯著提高，同時(shí)可保證不影響微藻的生物質(zhì)濃度，達(dá)到最大的油脂產(chǎn)率，可以作為生產(chǎn)生物柴油或其他生物能源生產(chǎn)的原料，生產(chǎn)的生物柴油不含硫，燃燒時(shí)不排放有毒害氣體，排入環(huán)境中也可被微生物降解，不污染環(huán)境。
[0042]實(shí)施例2
[0043]本發(fā)明涉及一種高溫脅迫微藻快速積累油脂、提高微藻產(chǎn)油效率的微藻培養(yǎng)方法。首先利用BGll培養(yǎng)基在溫度20°C，曝氣量500mL/min，光照強(qiáng)度50001ux的連續(xù)光照條件下，對(duì)微藻進(jìn)行培養(yǎng)。所培養(yǎng)的微藻為四尾柵藻，來(lái)自山東省環(huán)境科學(xué)工程技術(shù)研究中心，已保藏于中國(guó)科學(xué)院淡水藻種庫(kù)，保藏號(hào)為FACHB-1768。培養(yǎng)15天以后微藻達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末期，此時(shí)微藻的生物質(zhì)濃度達(dá)到最高為1.07?1.llg/L，油脂含量為23.4%?25.6%。然后將對(duì)數(shù)期末期的四尾柵藻放置于高溫30°C的環(huán)境中進(jìn)行脅迫培養(yǎng)，保持光照強(qiáng)度為50001ux連續(xù)培養(yǎng)6天。在6天的脅迫培養(yǎng)過(guò)程中，每天將微藻在3500r/min，6°C條件下進(jìn)行離心收獲，并檢測(cè)其生物質(zhì)濃度和油脂含量的變化。在培養(yǎng)I天后獲得油脂含量(占干重的百分?jǐn)?shù))最高的微藻，提高了約40%。上述實(shí)施例中測(cè)定微藻油脂含量的方法如下:
[0044]利用離心機(jī)將藻液于3500r/min，6°C下離心收獲，獲得的藻泥在冰箱內(nèi)冷凍成塊，然后用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行冷凍干燥，將干燥后的微藻在研缽中磨成粉末，并放入烘箱中烘干后保存待用。
[0045]本發(fā)明所述的高油脂含量微藻由于具有較高的油脂含量和不飽和脂肪酸比例，因此，可用于提煉汽油、柴油、航空燃油，以及作為塑料制品和藥物的原料。
[0046]本發(fā)明所述的高油脂含量微藻由于具有較高的油脂含量和不飽和脂肪酸比例，因此，可用于提煉汽油、柴油、航空燃油，以及作為塑料制品和藥物的原料。
[0047]上述雖然結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行了描述，但并非對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明白，在本發(fā)明的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員不需要付出創(chuàng)造性勞動(dòng)，即可做出的各種修改或變形，仍在本發(fā)明的保護(hù)范圍以內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種高溫脅迫微藻快速積累油脂的方法，其特征在于，培養(yǎng)微藻直至所述微藻的生長(zhǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末期，將上述微藻進(jìn)行在高溫環(huán)境中脅迫培養(yǎng)1-2天，離心，即得高油脂含量微藻。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)微藻的具體步驟為:以BGll為培養(yǎng)基，在溫度20-25°C，曝氣量500-600mL/min，光照強(qiáng)度5000-60001ux條件下培養(yǎng)微藻10-15 天。3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述微藻為四尾柵藻，來(lái)自山東省環(huán)境科學(xué)工程技術(shù)研究中心，藻種已保藏于中國(guó)科學(xué)院淡水藻種庫(kù)，保藏號(hào)為FACHB-1768。4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述微藻的生長(zhǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末期后，微藻的生物質(zhì)濃度為1.07?1.llg/L，油脂含量為23.4%?25.6%。5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述高溫條件為30-40°C。6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述離心條件為:于4-6°C、3500_4000r/min下離心5-lOmin。7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述高油脂含量微藻，其油脂含量為.32.6%?34.
【專利摘要】本發(fā)明屬于微藻生物能源研究領(lǐng)域，涉及一種高溫脅迫微藻快速積累油脂的方法，在反應(yīng)器中培養(yǎng)微藻，直至所述微藻的生長(zhǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末期，將上述微藻在高溫環(huán)境中脅迫培養(yǎng)1-2天，離心，即得高油脂含量微藻。本發(fā)明操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短、效率高、易于實(shí)現(xiàn)；不影響四尾柵藻生物質(zhì)濃度，有利于提高油脂產(chǎn)率；能促使四尾柵藻快速積累油脂，所述方法生產(chǎn)的高油脂微藻可用于提煉汽油、柴油、航空燃油，以及作為塑料制品和藥物的原料。
【IPC分類】C12N1/36, C12R1/89
【公開號(hào)】CN105132351
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510657796
【發(fā)明人】裴海燕, 韓飛, 胡文容, 聶昌亮, 成娟, 張立杰
【申請(qǐng)人】山東大學(xué)
【公開日】2015年12月9日
【申請(qǐng)日】2015年10月12日