一種用混合模式層析填料制備免疫球蛋白G Fc片段的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種從免疫球蛋白G的木瓜蛋白酶解液中純化Fe片段的方法，屬于Fe片段純化方法技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)是具有抗體活性的血清蛋白，又稱為抗體。是體液免疫應(yīng)答中發(fā)揮免疫功能最主要的免疫分子。人血清Ig分為G、M、A、D、E0 IgG是血清中主要的抗體成分，占血清總Ig的75%。IgG在機(jī)體免疫防護(hù)中起著主要的作用，大多數(shù)抗菌、抗病毒、抗毒素抗體都屬于免疫球蛋白G類抗體。其指標(biāo)對(duì)于診斷某些疾病具有意義。IgG分子量約為150KD，可以由木瓜蛋白酶酶解為分子量為45KD的Fab片段(antigen-binding fragment)和 55KD 的 Fe 片段(fragment crystalline)。Fe 片段相對(duì)于IgG抗體分子的Fab部分，在序列結(jié)構(gòu)上具有高度的保守性，因此由Fe片段免疫獲得的抗體相對(duì)于IgG全分子免疫獲得的抗體具有更高的專一"性。
[0003]目前蛋白質(zhì)純化采取的技術(shù)手段主要有親和層析、離子交換層析、疏水相互作用層析、鹽析沉淀等。IgG及其Fe片段的分離純化目前主要以Protein A、ProteinG此兩種親和層析介質(zhì)為主。Protein A是來源于金黃色葡萄球菌的蛋白，其對(duì)IgG分子的Fe片段有很強(qiáng)的親和力和特異性，在生理PH下兩者緊密結(jié)合，pH降低至3?4時(shí)，兩者又可解離。然而，實(shí)際應(yīng)用中Protein A親和層析存在介質(zhì)成本昂貴，且壽命周期較短；蛋白質(zhì)類型的配基易脫落，污染待純化抗體；洗脫條件較苛刻，容易對(duì)抗體造成傷害等缺點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明主要針對(duì)現(xiàn)有蛋白A親和層析存在介質(zhì)成本昂貴，壽命周期較短，蛋白質(zhì)類型的配基易脫落，污染待純化抗體，洗脫條件較苛刻，容易對(duì)抗體造成傷害等問題，提供一種用混合模式層析填料制備免疫球蛋白G Fe片段的方法。
[0005]本發(fā)明為解決上述問題而采取的技術(shù)方案為:
[0006]—種用混合模式層析填料制備免疫球蛋白G Fe片段的方法，包括以下步驟:
[0007](I)采用MEP HyperCel混合模式層析填料處理人血楽
[0008]采用MEP HyperCel混合模式層析填料處理人血漿，獲得免疫球蛋白IgG，首先使用平衡液A平衡裝有MEP HyperCel層析填料的層析柱，平衡至層析柱流出液pH值與平衡液A相同，再取人血漿低速離心后除去懸浮物，用平衡液A稀釋至3倍體積后，直接上樣于平衡后的層析柱，上樣后用平衡液A沖洗層析填料中未結(jié)合的成分，然后使用洗脫液A進(jìn)行洗脫，并收集洗脫組分，洗脫完畢后采用0.lmol/L氫氧化鈉對(duì)層析柱進(jìn)行在位清洗，之后再使用平衡液A平衡層析柱，其中所述平衡液A為三羥基氨基甲烷-鹽酸或磷酸鹽緩沖液，pH值為7?8，濃度不大于0.2mol/L,所述洗脫液A為0.05mol/L的醋酸鈉緩沖液，pH值為4.0?5.0 ;
[0009](2)木瓜蛋白酶水解IgG
[0010]更換緩沖液:將洗脫組分置于超濾管中，加入體積等體積的酶解緩沖液進(jìn)行超濾濃縮，重復(fù)5次，收集最后一次超濾組分，完成更換IgG緩沖液，；其中酶解緩沖液組成為:25mmoI/LNaH2P04-50mmoI/L NaCl，pH 值為 7.2，
[0011]木瓜蛋白酶水解IgG:在木瓜蛋白酶溶液中，分別加入四乙酸乙二胺和巰基乙醇，使溶液中四乙酸乙二胺和巰基乙醇的終濃度分別為4mmol/L和20mmol/L，并維持15分鐘使木瓜蛋白酶充分活化，然后將活化的木瓜蛋白酶加入最后一次超濾組分緩沖液中進(jìn)行酶切反應(yīng)，結(jié)束后加入過氧化氫終止反應(yīng)，制成IgG的木瓜蛋白酶解液，過氧化氫在反映體系中的終濃度介于0.8?1%，木瓜蛋白酶與IgG的質(zhì)量比彡1:20，酶切反應(yīng)時(shí)間大于等于8小時(shí)；
[0012](3)采用混合模式層析填料MEP HyperCel處理IgG的木瓜蛋白酶解液
[0013]將IgG的木瓜蛋白酶解液離心，除去懸浮物，上樣于經(jīng)平衡的MEP HyperCel層析柱，上樣完成后采用平衡液B沖洗，再用洗脫液B洗脫，洗脫組分即為純化的IgG Fe片段，洗脫結(jié)束后用0.lmol/L氫氧化鈉溶液清洗層析柱料，所述平衡液B的組成為:25mmol/LTris-HCl-50mmol/L NaCl pH為7.0±0.4 ;洗脫液B的組成為:100mmol/L三羥基氨基甲烷-醋酸-50mmol/L NaCl，pH 為 4.5±0.1。
[0014]本發(fā)明的原理是利用MEP HyperCel層析填料配基4_巰基乙基吡啶(MEP)與抗體保守區(qū)域含有大量色氨酸、苯丙氨酸等殘基的Fe片段特異性結(jié)合，當(dāng)流動(dòng)相的PH降低到4.0?4.55時(shí)，吡啶基團(tuán)解離并帶有正電荷，此時(shí)吸附的蛋白質(zhì)也帶正電荷，兩者產(chǎn)生靜電排斥而得到解離，從而得到純化的Fe片段。由于MEP HyperCel層析填料的配基為化學(xué)無機(jī)小分子，并通過共價(jià)鍵與層析填料基質(zhì)相連接，不易脫落，并可采用較高濃度得氫氧化鈉溶液進(jìn)行在線清洗，說明書使用壽命為proteinA層析介質(zhì)的5倍以上，化學(xué)無機(jī)小分子配基的脫落也不會(huì)影響Fe片段的免疫原性，采用MEP HyperCel層析填料時(shí)的抗體洗脫條件介于4.0-4.5之間，相對(duì)于proteinA層析填料采用的pH3.0-3.5條件較溫和，不易對(duì)抗體造成較大損傷。
[0015]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果:
[0016]本發(fā)明將混合模式吸附層析用于IgG Fe片段的分離純化。用MEP HyperCel混合模式吸附層析直接處理IgG的木瓜蛋白酶解液，充分利用填料配基對(duì)IgG Fe片段的特異性結(jié)合，實(shí)現(xiàn)較高PH條件的洗脫，在保持抗體片段活性的同時(shí)節(jié)省了后續(xù)流程，方法新穎方便，具備良好的經(jīng)濟(jì)性。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:(I)配基穩(wěn)定，再生容易，可多次重復(fù)使用；(2)洗脫條件溫和，不易引起產(chǎn)物結(jié)構(gòu)變異；(3)無需后續(xù)操作。洗脫后無需調(diào)節(jié)pH值及更換緩沖液；(4)化學(xué)配基價(jià)格相對(duì)較低，較為經(jīng)濟(jì)。
【附圖說明】
[0017]圖1是MEP HyperCel層析填料工作原理示意圖；
[0018]圖2是實(shí)施例1各步樣品SDS-PAGE電泳檢測(cè)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0019]實(shí)施例1