一種基于施氏假單胞菌細胞催化的秦皮甲素羥基保護反應方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物催化及生物醫(yī)藥合成與控制領域，具體涉及一種基于施氏假單胞 菌細胞催化的秦皮甲素羥基保護反應方法。
【背景技術】
[0002] 黃酮類化合物是兩個苯環(huán)通過三個碳原子相互連接而形成的一系列重要的多酚 類化合物，廣泛存在于幾乎所有的植物，尤其是蔬菜和水果；在醫(yī)藥、食品和化妝品上有很 大的應用價值。黃酮有多種生物活性包括抗氧化活性，抗炎，抗癌的，抗菌，抗過敏和抗 病毒等，然而，由于其多羥基結構的特點，大部分黃酮生物活性受限于其低脂溶性或水溶 性。位于苯環(huán)或配糖體骨架上的羥基對黃酮的生物和化學活性有重要的影響。黃酮的酯化 被認為一種很有前景的方法用于提高黃酮的溶解度，從而使黃酮展示出更多的生理活性。 已有研究表明，有選擇地修飾黃酮類化合物結構不僅可以提高物理化學屬性，例如，熱穩(wěn) 定性和脂溶性；而且增強其生物活性，如抗氧化活性；抗菌活性；細胞滲透能力；減肥和降 血脂功能。
[0003] 秦皮甲素水合物是黃酮的一種，具有抗炎、抗菌、抗血凝、鎮(zhèn)痛等活性，是枯草桿菌 的生長抑制劑，同時對化學性致癌亦有抑制作用。秦皮甲素水合物有5個羥基，分布在苯 環(huán)或者糖環(huán)上。環(huán)上的羥基對其活性有重要的影響，因此選擇性的對秦皮甲素水合物的羥 基進行酯化具有重要的意思，即可以保持其活性又可以增加其溶解度來增加其他方面的活 性。

【發(fā)明內容】

[0004] 利用傳統(tǒng)的化學方法通常難以對特定的羥基進行保護，本發(fā)明目的在于開發(fā)一種 保護秦皮甲素水合物6'羥基的方法。施氏假單胞菌細胞促秦皮甲素水合物?；磻淖?適有機溶劑、?；w、?；w與秦皮甲素水合物摩爾比、初始水含量、施氏假單胞菌細 胞催化劑用量、反應溫度和振蕩速度分別為50% (v/v)異辛烷-吡啶、丙酸乙烯酯（VP)、 20:1、0 %(v/v)、20g/L、40°C和180rpm，反應產(chǎn)率可達98.9 %。反應條件對施氏假單胞菌細 胞在秦皮甲素水合物丙?；磻械膮^(qū)域選擇性影響不大，6' -區(qū)域選擇性保持在94%以 上。
[0005] 該方法所用的催化劑制備簡單易操作，反應條件溫和，產(chǎn)率高，初速度快，羥基保 護區(qū)域選擇性可控制，克服了傳統(tǒng)化學方法的選擇性低而導致底物利用率低，產(chǎn)物純度低， 易生成副產(chǎn)物等缺點。
[0006] 本發(fā)明目的通過以下技術方案來實現(xiàn)：
[0007] -種基于施氏假單胞菌細胞催化的秦皮甲素羥基保護反應方法，包括以下步驟：
[0008] 1)制作施氏假單胞菌細胞催化劑：將細菌種子液接種至含產(chǎn)酶誘導劑的液體培 養(yǎng)基中，接種量為〇. 5%~20% (v/v)，培養(yǎng)條件為30°C~50°C，培養(yǎng)時間為12~144h ;離 心后收集菌體，蒸餾水洗滌兩次，經(jīng)真空冷凍干燥12h-36h，收獲菌體干粉，即為細菌細胞催 化劑；
[0009] 2)在帶塞三角瓶中加入有機溶劑；
[0010] 3)加入黃酮類水合物；
[0011] 4)加入?；w，形成有機溶劑反應體系；
[0012] 5)在有機溶劑反應體系中加入0~160 y L水；
[0013] 6)加入施氏假單胞菌細胞催化劑使整個反應體系最終質量為20~160mg，混合均 勻；
[0014] 7)置于水浴恒溫振蕩器反應，震蕩速度為100~260rpm。
[0015] 進一步地，可適當改變步驟2)所述帶塞三角瓶的體積來放大或縮小反應體系體 積；帶塞三角瓶體積為10mL ;步驟2)所述有機溶劑是單一種類有機溶劑或混合有機溶劑， 其中單一種類有機溶劑是吡啶，混合有機溶劑是乙腈-吡啶、叔丁醇-吡啶、叔戊醇-吡啶、 四氫呋喃-吡啶、正己烷-吡啶、異丙醚-吡啶、石油醚-吡啶或異辛烷-吡啶；步驟2)所 述有機溶劑為2mL體積比為1:1的異辛烷-吡啶；
[0016] 進一步地，步驟3)所述黃酮類水合物用量為10mmol/L-90mmol的秦皮甲素水合 物；
[0017] 進一步地，步驟4)所述?；w為用量為60~2400mmol的丙酸乙稀酯；
[0018] 進一步地，步驟5)所使用水為超純水或雙蒸水；反應溫度控制方法為水浴搖床恒 溫震蕩器水浴或恒溫搖瓶柜氣浴等；
[0019] 進一步地，步驟7)所述反應溫度為20 °C~50 °C。
[0020] 進一步優(yōu)化地，所述方法具體包括以下步驟：
[0021] 1)制作施氏假單胞菌細胞催化劑；
[0022] 2)在10mL帶塞三角瓶中加入2mL有機溶劑，可為純機溶劑或混合有機溶劑；
[0023] 3)加入秦皮甲素水合物；
[0024] 4)加入酰基供體丙酸乙烯酯，用量為60~2400mmol ;
[0025] 5)在2mL50% (v/v)異辛烷-吡啶反應體系中加入0-160 y L水；
[0026] 6)在2mL 50% (v/v)異辛烷-吡啶（VP)反應體系中加入施氏假單胞菌細胞催化 劑使整個反應體系最終質量為20~160mg ;
[0027] 8)秦皮甲素水合物羥基保護時反應溫度范圍為20°C~50°C，水浴恒溫振蕩器反 應；
[0028] 9)在水浴恒溫振蕩器振蕩反應，速度為100~260rpm。
[0029] 步驟2)中反應所使用的三角瓶體積不限于10mL，反應體系可適當放大或縮??；有 機溶劑是單一種類有機溶劑如吡啶或是混合有機溶劑，如乙腈-吡啶、叔丁醇-吡啶、叔戊 醇-吡啶、四氫呋喃-吡啶、正己烷-吡啶、異丙醚-吡啶、石油醚-吡啶或異辛烷-吡啶； 最佳混合有機溶劑為異辛烷-吡啶，所有混合有機溶劑最佳配比均為1 :1 (v/v)，但不限于 此配比。
[0030] 步驟7)恒溫震蕩器不限于水浴搖床，如恒溫搖瓶柜等氣浴條件也可。
[0031] 本發(fā)明與現(xiàn)有的技術相比具有如下的優(yōu)點：
[0032] 1.利用施氏假單胞菌細胞催化劑作為生物催化劑，較之化學催化劑反應條件溫 和、環(huán)境友好；較之酶催化劑成本低。
[0033] 2.該方法催化劑制備簡單易操作，酰基供體丙酸乙烯酯常用易購買，初速度快，產(chǎn) 率高，區(qū)域選擇性高，克服了傳統(tǒng)化學方法的選擇性低導致底物利用率低，產(chǎn)物純度低，易 生成副產(chǎn)物等缺點。
【具體實施方式】
[0034] 下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，但本發(fā)明的實施和保護范圍不限于 此。
[0035] 實施例1
[0036] 在10mL帶塞三角瓶中加入2mL吡啶、60mmol秦皮甲素水合物、1200mmol丙酸乙 烯酯和80mg施氏假單胞菌細胞催化劑，混合均勻，置于水浴恒溫振蕩器反應（40°C、180r/ min)，定時取樣20 iil，用60% (體積分數(shù)，下同）甲醇-水混合溶液稀釋50倍，混合均勻 后離心（15, 000r/min) 15min，自動進樣器取上清液20 y 1，供高效液相色譜分析。在純溶劑 吡啶中施氏假單胞菌細胞可以催化秦皮甲素水合物發(fā)生?；磻?，24后產(chǎn)率為16. 7 %，6 ' 區(qū)域選擇性為98. 6% ?
[0037] 菌種培養(yǎng)方法：斜面培養(yǎng)基，營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基；種子液培養(yǎng)24h后接種到發(fā)酵培 養(yǎng)基中，接種量為2% (V/v)，180r/m，30°C，培養(yǎng)48h。種子液培養(yǎng)基（w/v)為1%葡萄 糖，1% 牛肉膏，1% 蛋白胨，0.5% K2HP04,0 . 02%MgS04, 7H20,0.5% NaCl，pH 7.0±0. 1 ; 發(fā)酵培養(yǎng)基（￥八）為0.5%大豆油，0.1%酵母浸膏，0.5%(順4)230 4,0.1%1(2冊04,0 . 02% MgS04 ? 7H20〇
[0038] 實施例2
[0039] 在8個lOmL帶塞三角瓶中均加入60mmol秦皮甲素水合物和1200mmol丙酸乙烯 酯，再向8個帶塞三角瓶中分別加入2mL混合有機溶劑（體積分數(shù)為25%的乙腈-吡啶、 體積分數(shù)為25%的叔丁醇-吡啶、體積分數(shù)為25%的叔戊醇-吡啶、體積分數(shù)為25%的四 氫呋喃-吡啶、體積分數(shù)為25%的正己烷-吡啶、體積分數(shù)為25%的異丙醚-吡啶、體積分 數(shù)為25 %的石油醚-吡啶，體積分數(shù)為25 %的異辛烷-吡啶），最后向每個帶塞三角瓶中 均加入80mg施氏假單胞菌細胞催化劑，混合均勻，置于水浴恒溫振蕩器反應（40°C、180r/ min)，定時取樣10 y 1，用40%甲醇-水混合溶液稀釋100倍，混合均勻后離心（15, OOOr/ min) 15min，自動進樣器取上清液20 y 1，供高效液相色譜分析。反應結果如表1。
[0040] 表1含吡啶混合有機溶劑對施氏假單胞菌細胞促秦皮甲素水合物丙?；磻?影響
[0041 ]
[0042] 反應條件：2mL混合有機溶劑，80m施氏假單胞菌細胞催化劑，60mmol秦皮甲素水 合物，1200mmol丙酸乙稀酯，40°C，180rpm，反應24h。
[0043] a體積分數(shù)，v/v。
[0044] 實施例3
[0045] 在9個10mL帶塞三角瓶中均加入60mmol秦皮甲素水合物和1200mmol丙酸乙稀 酯（VA)，再向10個帶塞三角瓶中分別加入2mL不同體積分數(shù)的混合有機溶劑異辛烷-吡 啶（0%、5%、10%、15%、20%、30%，35%，40%，50% )，最后向