一種從枇杷葉中提取熊果酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域的提取方法，具體說是一種從枇杷葉中提取熊果酸的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]枇杷葉，薔薇科枇杷屬植物枇杷的干燥葉，在我國分布廣泛。是我國應(yīng)用廣泛的一種中藥，具有廣泛的藥理作用，主要表現(xiàn)在抗炎止咳、降血糖、抗病毒、抗氧化等許多方面。目前，枇杷葉的主要用途為經(jīng)水提法生產(chǎn)抗炎止咳藥枇杷露和枇杷膏。枇杷葉的化學(xué)成分結(jié)構(gòu)多樣，主要有揮發(fā)油、三萜酸類、倍半萜類、黃酮類、多酚類以及糖甙類等化合物。三萜類中的熊果酸純品為白色針狀結(jié)晶，熔點(diǎn)277°C，不溶于水和石油醚，易溶于乙醇和甲醇，可溶于苯、氯仿。熊果酸是五環(huán)三萜化合物，它具有抗致癌、抗促癌、誘導(dǎo)F9畸胎瘤細(xì)胞分化和抗血管生成作用。它是抗癌方面極具潛力的候選新藥，作為抗癌藥物具有極大的市場和較高的經(jīng)濟(jì)效益。
[0003]但是，熊果酸和齊墩果酸為兩個(gè)同分異構(gòu)體，為五環(huán)三萜類化合物，分子式為C30H48O3,性質(zhì)極為相似，在植物中常常共存，給分離測定帶來一定難度。紅外光譜根據(jù)區(qū)域A(1355-1392cm1)和區(qū)域B(1245-1330cm》的碳?xì)湮諄韰^(qū)別骨架類型，齊墩果酸在A區(qū)有兩個(gè)峰，B區(qū)有三個(gè)峰，熊果酸在A區(qū)和B區(qū)各有三個(gè)峰，以此可區(qū)分兩者?，F(xiàn)代藥學(xué)研究表明，熊果酸和齊墩果酸均具有消炎、增強(qiáng)免疫、抑制血小板凝集、降糖、抗癌等臨床藥理作用，是治療急性黃膽型肝炎和慢性病毒性肝炎的理想藥物，且毒性低副作用少。由于熊果酸和齊墩果酸的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，人工合成困難，國內(nèi)外均自中草藥或植物中提取。
[0004]在熊果酸分離純化技術(shù)中，多采用方法有溶劑提取法，超聲輔助提取法，以及超臨界萃取工藝，在熊果酸的分離純化方面，大多通過用石油醚結(jié)合活性炭脫色工藝，在經(jīng)過重結(jié)晶能到熊果酸晶體，另外李麗等人通過堿性乙醇除雜、活性炭脫色以及大孔吸附樹脂富集結(jié)合乙醇重結(jié)晶作用得到熊果酸晶體。相廷英等人則是通過用石油醚結(jié)合活性炭脫色工藝，在經(jīng)過重結(jié)晶能到熊果酸晶體，另外李麗等人通過堿性乙醇除雜、活性炭脫色以及大孔吸附樹脂富集結(jié)合乙醇重結(jié)晶作用得到熊果酸晶體。
[0005]在枇杷產(chǎn)區(qū)，枇杷葉、花、核這些具有較高附加值的部分基本上被浪費(fèi)掉，沒有得到應(yīng)有的應(yīng)用。通常在不影響枇杷果生產(chǎn)的前提下，全國可年采收枇杷葉干品5萬噸。因此，對(duì)枇杷葉進(jìn)行深度開發(fā)利用，有利于促進(jìn)枇杷產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展，對(duì)綜合利用枇杷資源，提高枇杷的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，開發(fā)新產(chǎn)品，具有十分重要的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種從枇杷葉中提取熊果酸的方法，具有工藝簡單，適合生產(chǎn)，生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)。
[0007]本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)，一種從枇杷葉中提取熊果酸的方法，具體包括如下步驟:
[0008]I)浸泡處理:將枇杷葉裝入編織袋，扎好口，放在水池里，水池加滿水，并在水池上面壓上重物，浸泡；
[0009]2)原料處理:將步驟I)得到的枇杷葉粉碎，加入相當(dāng)于原料2-3倍重量的純凈水，加熱至50-60°C維持5-10min，得到膏狀漿液；
[0010]3)酶解:將步驟2)得到的膏狀漿液，調(diào)pH為4-5，加入膏狀漿液0.05-0.1%重量份的果膠-纖維素復(fù)合酶和0.001重量份的甘露醇進(jìn)行酶解40-60min，得到酶解液；
[0011 ] 4)去油:將步驟3)得到的酶解液，加入2-3倍重量的純凈水，加熱至60-70°C浸提60-120min，得上層浮油液與下層液、渣混合物，分離；
[0012]5)醇提:向步驟4)得到的下層液、渣混合物加入70-80% (v/v)乙醇水溶液，進(jìn)行提??；
[0013]6)柱層析:合并步驟5)得到提取液，離心，得上清液，濃縮，用大孔吸附樹脂進(jìn)行吸附，用去離子水清洗樹脂至流出液體為無色，再用濃度為75-80% (v/v)的乙醇溶液洗脫，收集洗脫液；
[0014]7)重結(jié)晶:將步驟6)得到的洗脫液濃縮得浸膏，用75% (v/v)乙醇水溶液溶解，濃縮回收乙醇，調(diào)pH至3-4，用乙醇結(jié)晶3-4次，得到高純度的熊果酸。
[0015]本發(fā)明步驟I)所述的浸泡，時(shí)間優(yōu)選15_24h。
[0016]步驟3)所述的果膠-纖維素復(fù)合酶，優(yōu)選活性是1-3萬活性單位/克的固態(tài)果膠-纖維復(fù)合酶。
[0017]步驟5)所述的醇提，優(yōu)選加入量為步驟4)得到的下層液、渣混合物體積的3-5倍，加熱提取2次，溫度80-100°C，每次30-60min。
[0018]步驟6)所述的離心，優(yōu)選轉(zhuǎn)速為3500r/min，時(shí)間lOmin，所述的大孔吸附樹脂型號(hào)優(yōu)選DlOl型、HPDlOO型。
[0019]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn):
[0020]1、枇杷葉的植物細(xì)胞內(nèi)含有油脂，主要由成分為甘油三酯的化合物組成的混合物，這些油脂以油粒和油體原生質(zhì)體形式、呈不連續(xù)顆粒狀、與顆粒蛋白體一起無規(guī)則地分散在細(xì)胞內(nèi)等存在形式存在?，F(xiàn)有的提取方法，都是直接對(duì)枇杷葉等原料打碎或粉碎后通過水提/醇提、或者微波提取等方式直接提取，在提取的時(shí)候，細(xì)胞中的油脂會(huì)同時(shí)分離出，含有油脂的基團(tuán)和熊果酸、齊墩果酸、色素等成分混在一起，從而影響后續(xù)有效成分的分離，增加了工序的處理難度。本發(fā)明先采用酶提取植物油脂，利用非油成分對(duì)油和水的親和力差異及油水比重不同而將油和非油成分分離，增加了產(chǎn)品收率和提高了提取率。
[0021]2、本發(fā)明采用枇杷葉水池浸泡，枇杷葉浸泡在水里，葉子逐漸軟化，水分自然進(jìn)入到內(nèi)部，利于植物油脂的分離，利于后續(xù)酶解、去油；同時(shí)，葉子浸泡在水里，厭氧細(xì)菌大量繁殖，特別是夏天的時(shí)候，會(huì)變酸，PH值會(huì)降低，方便后面工序的調(diào)整pH。
[0022]3、本發(fā)明先采用果膠-纖維素復(fù)合酶去除細(xì)胞壁，釋放植物細(xì)胞中的油脂，加入甘露醇，可以保持滲透壓，利于油脂的釋放，同時(shí)也可以破壞色素，得到的產(chǎn)品色澤比現(xiàn)有產(chǎn)品淺。
[0023]4、本發(fā)明得到的熊果酸，經(jīng)HPLC檢測，含量在99%以上，得率比現(xiàn)有技術(shù)提高20%以上。
【具體實(shí)施方式】
[0024]下面以實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明并不局限于這些實(shí)施例。
[0025]實(shí)施例1:
[0026]—種從枇杷葉中提取熊果酸的方法，具體包括如下步驟:
[0027]I)浸泡處理:將枇杷葉裝入編織袋，扎好口，放在水池里，水池加滿水，并在水池上面壓上重物，浸泡24h ；
[0028]2)原料處理:將步驟I)得到的枇杷葉粉碎，加入相當(dāng)于原料2倍重量的純凈水，加熱至60°C維持5min，得到膏狀楽液；
[0029]3)酶解:將步驟2)得到的膏狀