線粒體相關精漿微小核糖核酸作為人類嚴重弱精子癥發(fā)生的標志物及其應用
【專利說明】線粒體相關精漿微小核糖核酸作為人類嚴重弱精子癥發(fā)生 的標志物及其應用 發(fā)明領域
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程及生殖醫(yī)學領域，涉及線粒體相關精漿微小核糖核酸作為人 類嚴重弱精子癥發(fā)生的標志物及其應用。
【背景技術】
[0002] 不孕不育一直是生殖健康領域亟待解決的重大科學問題。在我國約有9%的育齡 夫婦面臨此種困境。由于我國人口基數大，育齡夫婦數量尤為可觀，新婚夫婦中不孕不育的 患者人數遠超過百萬。不孕不育癥的病因很多，其中由男方因素引起的約占50%。WHO不 育癥防治專題組的研究表明，生殖內分泌功能紊亂，特別是弱精癥是造成男性不育或生育 力下降的主要原因之一。
[0003] 弱精子癥（asthenospermia)是指精液參數中前向運動的精子（a和b級）小于 50%或a級運動的精子小于25%的病癥。而嚴重弱精子癥是指b級+c級精子數量〈30%， 其中a級精子為零。大量研究表明，弱精子癥（特別是嚴重弱精子癥）會導致受孕幾率顯 著降低，同時還會引起流產、早產、輸精管阻塞等一系列危害。
[0004] 目前，弱精子癥的診斷方法主要依靠病史詢問、體格檢查、精液參數、精漿生化、血 性激素檢測、B超以及染色體檢測等。常規(guī)的精子活力分析目前主要依靠計算機輔助精子 分析（Computer-aided sperm analysis, CASA)，尚無其他更為有效的手段，但其自身存在 一定的缺陷，即精液參數的檢測易受到禁欲天數、溫度、采集精液方法等因素的影響，從而 造成精子活力測量不準確；對相應疾病的早期診斷效果也遠不能滿足需要。盡管目前國內 外研究者正努力探索新的弱精子癥診斷生物標志物，并對現有評估手段進行有效的補充， 但一直難以突破傳統(tǒng)生物標志物發(fā)展和男性生殖實際應用中的瓶頸，即精液質量分析結果 波動、早期診斷困難等。此外，由于病因不明，缺乏有效的治療手段，大多數弱精子癥病人只 能選擇ICSI或AID等輔助生育手段，不僅無法滿足心理上的需求，而且有可能出現后代的 遺傳缺陷。
[0005] 目前認為，導致弱精子癥的病因主要有：生殖道感染、免疫因素、精索靜脈曲張、先 天性疾病等。其發(fā)病機制主要包括兩方面：（1)由遺傳或先天因素導致的精子鞭毛超微結 構的損傷；（2)由氧化應激、代謝紊亂、抗精子抗體等引起的精子ATP合成減少，活力退化。
[0006] 線粒體（mitochondria)作為"能量工廠"，參與維持多種細胞功能，是細胞發(fā)揮功 能所需能量的主要來源。ATP是精子活力的首要能量來源，它主要來自兩個途徑：線粒體的 有氧氧化和胞質的無氧酵解。經典的理論認為精子中段線粒體形成的線粒體鞘在精子運動 過程中提供所需能量，一切影響ATP生成的因素，如呼吸酶抑制劑等均可直接或間接影響 精子活力。精子獲能以后代謝活動明顯增強，提示精子線粒體中氧化磷酸化產生大量ATP， 使得精子出現一種特異的"鞭打樣"運動方式，通過此種運動方式，精子穿過卵子透明帶而 受精。由此可見，當線粒體功能出現損傷時，將會影響ATP的產生，也必將影響精子活力，導 致生育障礙。
[0007] 微小核糖核酸（microRNA，即miRNA)是近年剛剛興起的研究熱點，它是一類長約 19-23個核苷酸的單鏈RNA分子，多位于基因組非編碼區(qū)，進化上高度保守，可在轉錄后水 平對基因表達進行調節(jié)，并與生物的許多正常生理活動密切相關，同時也與許多疾病的發(fā) 生及發(fā)展存在著緊密的聯系。在人類中已發(fā)現了 2000余種miRNAs，目前，預測miRNA至 少能調控數千個人類基因，占所有基因的30%以上。miRNA不編碼蛋白質，而是以單鏈形 式與輔酶因子TRBP及PACT形成RNA誘導沉默復合物（RISC)，再與mRNA的3'端非編碼 區(qū)（3' UTR)結合，從而發(fā)揮其調控mRNA轉錄與蛋白翻譯的總開關作用。miRNA在其5'端 有一個2-7個喊基組成的互補區(qū)，通過與革E mRNA的3'UTR(three prime untranslated regions)的完全或部分靶向互補結合導致其降解或抑制轉錄后的翻譯。作為21世紀生命 科學的重大發(fā)現，越來越多的研究顯示，其參與的細胞轉錄后調控，在個體發(fā)育、細胞胞增 殖、分化、代謝和凋亡等多種生物學過程中發(fā)揮著重要的調節(jié)作用。有大量文獻報道，miRNA 在男性生殖細胞的增殖以及晚期精子分化的過程中都發(fā)揮著非常關鍵的作用。研究表明， 核編碼miRNA可以進入線粒體參與線粒體功能的調節(jié)，同時，最新研究發(fā)現，線粒體自身基 因組也可以編碼大量非編碼RNA，進而發(fā)揮多種生物學功能。這些miRNA被稱為線粒體相關 miRNA(mitochondria-related miRNA)〇
[0008] 研究發(fā)現血漿中存在上百種的miRNA，性質穩(wěn)定、含量豐富、易于定量檢測，且存在 顯著的疾病特異性，在肺癌、結腸癌中已經證實血漿miRNA的表達譜可作為早期診斷的潛 在生物標志物。而近期又有學者發(fā)現，精漿中同樣也存在數百種miRNA，且這些miRNA同樣 具備作為生物標志物的所有特性，如性質穩(wěn)定、含量豐富、易于檢測等。這一發(fā)現使我們有 理由相信，精漿miRNA作為一類非編碼調節(jié)性的小分子RNA，其差異表達譜同樣也可以作為 疾病早期診斷的生物標志物。
[0009] 目前還沒有將線粒體相關miRNA應用于嚴重弱精子癥診斷的報道，若能篩選出嚴 重弱精子癥易感的線粒體相關miRNA作為生物標志物，并研制相應的診斷試劑盒，對嚴重 弱精子癥的診斷現狀必將是一次有力的推動，也為其藥物篩選、藥效評價及靶向治療開辟 了一條新的途徑。

【發(fā)明內容】

[0010] 本發(fā)明的目的是提供與人類嚴重弱精子癥發(fā)生相關的線粒體相關精漿miRNA標 志物。
[0011] 本發(fā)明的第二個目的是提供上述精漿miRNA標志物的引物。
[0012] 本發(fā)明的第三個目的是提供含有上述精漿miRNA標志物或其引物的應用。
[0013] 本發(fā)明的第四個目的是提供含有上述精漿miRNA標志物或其引物的用于人類嚴 重弱精癥診斷或監(jiān)測的試劑盒。
[0014] 本發(fā)明的目的是通過下列技術措施實現的：
[0015] 人類嚴重弱精子癥發(fā)生相關的精漿miRNA標志物，這些miRNA為線粒體相關 miRNA，選自 hsa-miR-101-3p、hsa-miR-151a_5p 和 hsa-let-7b_5p 中的多種。
[0016] 所述的精衆(zhòng)miRNA標志物由 hsa-miR-101-3p、hsa-miR-151a_5p 和 hsa-let-7b_5p 構成。
[0017] 所述的精衆(zhòng)miRNA標志物，其中hsa-miR-101_3p的序列 為 UACAGUACUGUGAUAACUGAA (SEQ ID No. 1),hsa-miR-151a-5p 的序列 為 UCGAGGAGCUCACAGUCUAGU(SEQ ID No. 2)，hsa_let_7b_5p 的序列為 UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU(SEQ ID No. 3)〇
[0018] 所述的精漿miRNA標志物的引物，其中序列為SEQIDNo. 1的標志物的上游引物 為SEQIDNo. 4,下游引物為SEQIDNo. 5;序列為SEQIDNo. 2的標志物的上游引物為SEQ IDNo. 6,下游引物為SEQIDNo. 7;序列為SEQIDNo. 3的標志物的上游引物為SEQID No. 8,下游引物為SEQIDNo. 9。
[0019] 所述的精漿miRNA標志物或其引物在制備嚴重弱精子癥診斷或監(jiān)測試劑中的應 用。所述試劑是能夠測定這些精漿miRNA標志物在精漿中表達量的試劑。
[0020] -種人類嚴重弱精子癥診斷或監(jiān)測試劑盒，該試劑盒含有上述精漿miRNA標志物 (hsa-miR-101- 3p、hsa-miR-l5la_5p 和 hsa-let-7b-f5p 中的多種）的引物。
[0021] 所述的診斷試劑盒，該試劑盒