Dc-cik細(xì)胞及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種DC-CIK細(xì)胞及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]惡性腫瘤是當(dāng)前危害人類健康的主要疾病之一，在傳染病得到基本控制的國(guó)家，心腦血管疾病和惡性腫瘤已分別成為死亡原因的第I和第2位。據(jù)統(tǒng)計(jì)全世界2000年新發(fā)腫瘤病例約1010萬(wàn)，中國(guó)約180萬(wàn)。全世界2000年死于惡性腫瘤的約有620萬(wàn)，中國(guó)約120萬(wàn)。在這120萬(wàn)人中，死于胃癌的24萬(wàn)、食管癌22萬(wàn)、肝癌17.5萬(wàn)、宮頸癌10萬(wàn)、肺癌13萬(wàn)、結(jié)腸乂直腸癌9萬(wàn)、白血病6萬(wàn)以及其它腫瘤15萬(wàn)。發(fā)達(dá)國(guó)家主要癌癥為肺癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、胃癌和前列腺癌；發(fā)展中國(guó)家主要為宮頸癌、胃癌、肝癌、食管癌、乳腺癌和肺癌。
在腫瘤治療方法中，免疫治療已成為手術(shù)治療，化療和放療之外最重要的、最有希望的治療手段。在過(guò)去的20年里，腫瘤特異性主動(dòng)免疫治療和過(guò)繼免疫治療兩個(gè)方面研究都有很大的發(fā)展。
在腫瘤過(guò)繼免疫治療中，先后出現(xiàn)了五種引人注目的免疫效應(yīng)細(xì)胞。這就是淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞(LAK 細(xì)胞)(Rosenberg SA, etal.N.Engl.J.Med.313:1485-1492，1985)，腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(TIL 細(xì)胞)(Itoh K，et alj Exp.Med.168:1419-1441, 1988),抗白細(xì)胞分化抗原-3單克隆抗體(CD3化單抗)和白細(xì)胞介素-2 (IL-2)誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(AK-T細(xì)胞)(Uberti JP, et al.Clin.1mmunol，Immunother，70:234-240，1994)，細(xì)胞毒性 T 淋巴細(xì)胞(CTL)，(Aruga A，et al.1nt.J.Cancer，49:19-24，1991)細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(CIK 細(xì)胞)(Schmidt-woIf IGH, et al.J.Exp.Med.174:139-149，1991)。多年的臨床前和臨床研究發(fā)現(xiàn)曾被認(rèn)為具有巨大免疫治療價(jià)值的LAK細(xì)胞因其增殖性能不理想和細(xì)胞毒活性較低且維持時(shí)間較短而漸被冷落。CTL和TIL，特別是CTL，從理論上是最被看好的免疫效應(yīng)細(xì)胞，因目前尚無(wú)有效擴(kuò)增手段及其他一些限制因素而未被臨床廣泛應(yīng)用。于是人們逐漸把希望移向了后二種效應(yīng)細(xì)胞一AK-T細(xì)胞和CIK細(xì)胞。AK-T細(xì)胞和CIK細(xì)胞都是用抗CD3單抗為刺激因子激發(fā)T淋巴細(xì)胞增殖，具有相同的增殖活性。CIK細(xì)胞還有賴于其它細(xì)胞因子的參與，因此，CIK細(xì)胞具有比AK-T細(xì)胞更強(qiáng)的細(xì)胞毒活性。但是，與AK-T細(xì)胞和LAK細(xì)胞一樣，CIK細(xì)胞也不具有特異性識(shí)別和殺傷腫瘤細(xì)胞的特性。
在眾多腫瘤主動(dòng)特異性免疫治療方法中，樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)作為新一代腫瘤疫苗的研究和應(yīng)用成為近年來(lái)主動(dòng)免疫治療研究中的熱點(diǎn)。在機(jī)體免疫反應(yīng)中，DC是最主要的抗原提呈細(xì)胞，具有捕獲、加工處理抗原和向T淋巴細(xì)胞提呈抗原分子、表達(dá)共刺激分子、釋放細(xì)胞因子和白細(xì)胞介素等特性。因此，DC在腫瘤細(xì)胞免疫應(yīng)答中起主要免疫調(diào)節(jié)作用，是腫瘤主動(dòng)特異性免疫最重要的免疫輔佐細(xì)胞。
當(dāng)DC與CIK細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，彼此能互相作用而誘導(dǎo)出比CIK細(xì)胞有更強(qiáng)增殖活性、更高腫瘤細(xì)胞殺傷活性的細(xì)胞群(Marten A AK-et al.J.1mmunother 24(6):502-510，2001)。但是這種細(xì)胞對(duì)惡性細(xì)胞的攻擊與CIK細(xì)胞一樣缺乏抗原特異性。PeterM等人曾發(fā)現(xiàn)，當(dāng)DC細(xì)胞經(jīng)用腫瘤相關(guān)抗原沖擊后與腫瘤侵潤(rùn)淋巴細(xì)胞(TIL)共培養(yǎng)時(shí)，誘導(dǎo)出的效應(yīng)細(xì)胞具有明顯的對(duì)惡性細(xì)胞的特異性攻擊的能力(Peter M，et al.Clin.Cancer Res.5:445-454,1999)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是:提供一種DC-CIK細(xì)胞及其制備方法，它改善現(xiàn)有技術(shù)中抗腫瘤免疫效應(yīng)細(xì)胞在增殖活性、細(xì)胞毒活性以及對(duì)腫瘤細(xì)胞特異識(shí)別和攻擊的活力的不足。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的:DC-CIK細(xì)胞的制備方法，包括如下步驟:
1)PBMC的制備:將已經(jīng)取得的抗凝外周血10ml采用生理鹽水對(duì)倍稀釋后，用比重為1.077的淋巴細(xì)胞分離液分離PBMC，然后用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行下細(xì)胞計(jì)數(shù)，最后用AIM-V培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)胞密度成3-5X 106/ml的細(xì)胞懸液；
2)DC細(xì)胞和T細(xì)胞的分離:將細(xì)胞懸液移入培養(yǎng)皿中，置37°C，體積百分比為5%的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中溫育3小時(shí)，然后用移液管滴洗細(xì)胞，將非粘附T細(xì)胞懸液收集在離心管中，培養(yǎng)皿中留下的粘附細(xì)胞作誘導(dǎo)DC用；
3)CIK細(xì)胞的誘導(dǎo)和擴(kuò)增:步驟2)中獲得的T細(xì)胞懸液中添加重組人IFN- γ終濃度為1000u/ml，然后移入培養(yǎng)瓶中，置于37°C，體積百分比為5%的0)2飽和濕度培養(yǎng)箱中溫育24小時(shí)，之后，每瓶添加鼠抗人⑶3單克隆抗體，IL-1和IL-2，終濃度分別為50ng/ml，100u/ml和500u/ml ;或者采用固相⑶3單抗刺激的方法，即將全部細(xì)胞懸液移入⑶3單抗包被過(guò)的T75培養(yǎng)瓶中，再添加IL-1和IL-2，終濃度分別為100u/ml和500ug/ml ;繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后細(xì)胞計(jì)數(shù)，然后用A頂-V培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為6 X 105/ml，分配到T175培養(yǎng)瓶中，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，此后，每隔48小時(shí)按上述相同條件擴(kuò)大培養(yǎng)一次，培養(yǎng)至第8天時(shí)收集CIK細(xì)胞待用；
4)DC誘導(dǎo)和擴(kuò)增:在前述留有粘附細(xì)胞的培養(yǎng)皿中加入DC培養(yǎng)液，370C，體積百分比為5%的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)5天，然后添加自體瘤細(xì)胞裂解液，使裂解液蛋白終濃度為50ug/ml，繼續(xù)培養(yǎng)6天后，用移液管沖吸和收集非粘附和半粘附性DC細(xì)胞待用；
5)DC與CIK細(xì)胞共培養(yǎng)制備DC-CIK細(xì)胞:將待用的DC和CIK細(xì)胞，分別計(jì)數(shù)，離心棄上清后，混合后移入培養(yǎng)瓶中，置37°C，體積百分比為5%的0)2飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每隔48小時(shí)按9X 105/ml的起始細(xì)胞密度分瓶擴(kuò)大培養(yǎng)一次。
步驟I)中，分離所用離心機(jī)之轉(zhuǎn)頭為水平轉(zhuǎn)頭，離心速度為2000rpm，離心18分鐘。步驟3)中，采用固相CD3單克隆抗體刺激的步驟具體為:包括在AIM-V中加入CD3單抗，使成為CD3單抗?jié)舛葹?-10ug/ml的包被液，在培養(yǎng)瓶中加入包被液，40°C過(guò)夜或者37°C溫育2小時(shí)后，棄去全部包被液體，然后移入經(jīng)IFN- γ處理過(guò)的PBL懸液接受⑶3單抗刺激。
所述的步驟4)中，自體瘤細(xì)胞裂解液的制備步驟如下:將已切除的腫瘤組織用Hank’s平衡液洗去血液，剪除壞死組織，結(jié)締組織和脂肪組織，留下瘤組織，剪碎后用勻漿器研磨，再反復(fù)凍融5次，加適量!^1^’8平衡液，3000印!11離心10分鐘，收集上清并取樣測(cè)蛋白濃度后于-20°C貯存，貯存腫瘤細(xì)胞裂解液之蛋白濃度不低于lmg/ml。
采用上述的方法制備得到的DC-CIK細(xì)胞。
采用上述方法制備得到的DC-CIK細(xì)胞。 以上制備過(guò)程中所用吸管和離心管為聚丙稀(polypropylene)材料，6孔板和培養(yǎng)瓶為聚苯乙烯(polystyrene)材料。此外，若改用其他規(guī)格培養(yǎng)器皿，應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)面積大小調(diào)整上述細(xì)胞懸液接種量。
上述共培養(yǎng)得到的DC-CIK細(xì)胞與LAK、CIK細(xì)胞一樣為一非均質(zhì)細(xì)胞群，其主要生物學(xué)特性有:
(1)細(xì)胞組成=DC-CIK細(xì)胞中T淋巴細(xì)胞占98%以上和少量DC。T淋巴細(xì)胞中各亞群所占比例具有個(gè)體差異和因體外培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)短而有一定變化范圍。一般為(CD3+CD4+T細(xì)胞 20-40%，CD3+CD8+T 細(xì)胞 50_80%，CD3+CD56+T 細(xì)胞(NKT 細(xì)胞)10-50%,以及很可能存在的 CTL (CD8+)；
(2)增殖活性高:DCIK細(xì)胞增殖活性比CIK細(xì)胞強(qiáng)大。體外擴(kuò)增3-4周后，D