一種花菁類化合物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及用于檢測超氧陰離子（O2 )和硫烷硫的熒光探針，具體的說是一種花 菁類化合物及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 生物體內(nèi)高濃度的H2S可抑制線粒體呼吸，與此相反，硫烷硫的細(xì)胞毒性卻非常 低。在小鼠組織中，高速率的H2S生成和降解過程依賴著線粒體中活性氧的分解代謝來平 衡。線粒體產(chǎn)生的O2可將H2S迅速轉(zhuǎn)化為硫烷硫穩(wěn)定儲(chǔ)存起來，直到響應(yīng)生理信號(hào)時(shí)才會(huì) 被釋放。線粒體中硫烷硫的含量約占細(xì)胞總含量的60%以上。有證據(jù)表明，受控的O2產(chǎn)生 的過程，可以激活硫化氫和硫烷硫的可逆互變狀態(tài)，從而介導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、調(diào)控細(xì)胞增殖 和凋亡、調(diào)節(jié)機(jī)體正常生理過程、控制免疫系統(tǒng)應(yīng)答。從目前研究來看，用于檢測分析O2介 導(dǎo)硫烷硫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的三個(gè)前提需要進(jìn)行重新評(píng)估：1)前期報(bào)道認(rèn)為生物體內(nèi)可耐受的H2S 水平幅度，比新的實(shí)驗(yàn)證據(jù)高幾個(gè)數(shù)量級(jí)；2)在體外系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)時(shí)，所檢測的硫化氫可能是 還原硫烷硫產(chǎn)生的；3)在活性氧存在下，外源補(bǔ)充硫化氫的同時(shí)也會(huì)補(bǔ)充硫烷硫。由于存 在受活性氧調(diào)控的H2S和硫烷硫的可逆互變，目前無法將H2S和硫烷硫割裂開來研究。在未 來研究中，區(qū)分細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能是H2S誘導(dǎo)的效應(yīng)，還是硫烷硫介導(dǎo)的效果將是重要的努 力方向。因此，細(xì)胞線粒體內(nèi)的硫烷硫在多大程度上以及通過什么機(jī)制受O2調(diào)控、并開啟 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路仍有待進(jìn)一步明確。這就需要新的實(shí)驗(yàn)證據(jù)證明：在硫化氫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中， 硫烷硫分子是否為實(shí)際的信號(hào)傳導(dǎo)分子。如果該情況得到證實(shí)，那么H2S可能只是基于硫 烷硫信號(hào)傳導(dǎo)終端所釋放的終產(chǎn)物，即作為硫烷硫的還原產(chǎn)物。這也與生理狀態(tài)的H2S濃 度總是保持在較低的濃度（nM)相一致。本專利中所涉及的熒光探針將有助于探索H2S可 能不是實(shí)際的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，許多生理效應(yīng)是基于硫烷硫介導(dǎo)和調(diào)控的結(jié)果，以期解 決這個(gè)關(guān)鍵的問題。
[0003] 鑒于O2調(diào)控硫烷硫細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要生物醫(yī)學(xué)意義，發(fā)展用于檢測O 2和 硫烷硫濃度變化水平的分析方法已經(jīng)變得越來越迫切。目前，用于檢測O2的方法有：電子 順磁共振法，SOD酶活性測定法，高效液相色譜法（HPLC)以及電化學(xué)方法；用于檢測硫烷硫 的方法有：比色法，電化學(xué)分析，色譜分析法。但是這些方法往往需要試樣預(yù)處理，熒光探 針方法以其高時(shí)空分辨、操作簡便和原位非損傷檢測等優(yōu)點(diǎn)，在生物活性物種檢測領(lǐng)域，已 成為一種功能強(qiáng)大的研究輔助工具。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種花菁類化合物及其應(yīng)用。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0006] -種花菁類化合物，花菁類化合物如通式I所示，
[0007]
[0008] 通式I中，
[0009] R1為烷基鏈或有機(jī)酸酯鏈；
[0010] R2為三苯基鱗陽離子或丙基嗎啉；
[0011] X 為 N、0 或 S;
[0012] Y 為-SH、-SeH 或-TeH 基團(tuán)。
[0013] 所述烷基為C4 22的烷基；有機(jī)酸酯為甲酸酯或丁酸酯。
[0014] 進(jìn)一步的說，所述通式I中R1為有機(jī)酸酯鏈、R2為三苯基鱗陽離子或丙基嗎啉；X 為 N、0 或 S ;Y 為-SH、-SeH 或-TeH 基團(tuán)。
[0015] -種花菁類化合物的應(yīng)用，以所述通式I所示的花菁類化合物作為O2或硫烷硫 的熒光探針。
[0016] -種熒光探針：熒光探針為通式I所示的以花菁染料作為熒光母體，并在母體上 引入親脂性基團(tuán)有機(jī)酸酯鏈或烷基，對(duì)具備線粒體、溶酶體定位功能團(tuán)的三苯基鱗、嗎啉或 檢測基團(tuán)Y。
[0017] 所述檢測基團(tuán)Y為-SH、-SeH或-TeH基團(tuán)。
[0018] 所述熒光探針用于定性/定量的檢測生理環(huán)境下細(xì)胞或生物體內(nèi)外的O2或硫烷 硫濃度。
[0019] 本發(fā)明的有益效果：
[0020] 本發(fā)明化合物用于作為O2和硫烷硫聯(lián)動(dòng)檢測的熒光探針，其在檢測O2前后熒 光探針吸收和熒光發(fā)射最大波長會(huì)有改變；檢測硫烷硫前后熒光探針熒光發(fā)射強(qiáng)度會(huì)有所 改變?？捎糜谒w系、模擬生理環(huán)境和細(xì)胞內(nèi)O2和硫烷硫水平的聯(lián)動(dòng)檢測，并可大大降低 外部檢測條件的干擾，提高檢測精度。本發(fā)明化合物用作熒光探針，可用于細(xì)胞內(nèi)O2和硫 烷硫聯(lián)動(dòng)檢測，這對(duì)深入研究O2和硫烷硫在生物體內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程和機(jī)理，進(jìn)一步了解 O2和硫烷硫的生理和毒理作用具有重要的生物醫(yī)學(xué)意義。
【附圖說明】
[0021] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的采用的熒光探針對(duì)O2檢測前后熒光變化。
[0022] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例提供的所采用的熒光探針對(duì)O2的選擇性示意圖；其中，橫坐 標(biāo)從左至右依次為：超氧陰離子、羥基自由基、雙氧水、脂質(zhì)過氧化物、枯析氫過氧化物、過 氧化叔丁醇、一氧化氮、過氧化亞硝、次氯酸。
[0023] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例提供的所采用的熒光探針對(duì)硫烷硫檢測前后熒光光譜的變 化。
[0024] 圖4為本發(fā)明實(shí)施例提供的所采用的熒光探針對(duì)硫烷硫的選擇性示意圖；其中， 橫坐標(biāo)從左至右依次為：過硫化鈉、多硫半胱氨酸、斜方硫、硫化氫、谷胱甘肽、半胱氨酸、高 半胱氨酸、氧化型半胱氨酸、氧化型谷胱甘肽。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 突光探針通式為：
[0026]
[0027] 通式I中，
[0028] R1為烷基或有機(jī)酸酯；
[0029] R2為三苯基鱗陽離子或丙基嗎啉；
[0030] X 為 N、0 或 S ;
[0031] Y 為-SH、-SeH 或-TeH 基團(tuán)；
[0032] 優(yōu)選為：
[0033] X為0時(shí)，所述花菁類化合物的通式為：
[0034]
[0035] 通式II中：
[0036] R1為乙基鏈；
[0037] R2三苯基鱗陽離子或丙基嗎啉；
[0038] Y 為-SH、-SeH 或-TeH 基團(tuán)；
[0039] 將通式I與待測定水體、模擬生理環(huán)境或生物體內(nèi)外的超氧陰離子反應(yīng)從而導(dǎo)致 熒光強(qiáng)度的改變，所得通式III結(jié)構(gòu)的化合物；
[0040]
[0041] 將通式III與待測定水體、模擬生理環(huán)境或生物體內(nèi)外的硫烷硫反應(yīng)從而導(dǎo)致熒 光強(qiáng)度的改變，所得通式IV結(jié)構(gòu)的化合物；
[0042]
[0043] 將通式II結(jié)構(gòu)應(yīng)用于檢測超氧陰離子時(shí)，與O2作用后，生成具有通式VI結(jié)構(gòu)的 化合物，從而導(dǎo)致熒光強(qiáng)度的改變；
[0044]
[0045] 將通式VI結(jié)構(gòu)應(yīng)用于檢測硫烷硫時(shí)，與硫烷硫作用后，生成具有通式VII結(jié)構(gòu)的 化合物，從而導(dǎo)致熒光波長的改變；
[0046]
[0047] 通式III可對(duì)O2或硫烷硫進(jìn)行定性、定量的檢測。
[0048] 本發(fā)明中使用的術(shù)語"有機(jī)酸酯鏈"包括直鏈有機(jī)酸酯基和支有機(jī)酸酯基。如提 及單個(gè)烷基如"丙基"，則只特指直鏈烷基，如提及單個(gè)支鏈烷基如"異丙基"，則只特指支鏈 烷基。類似的規(guī)則也適用于本說明書中使用的其它基團(tuán)。
【具體實(shí)施方式】 [0049]
[0050] 實(shí)施例用于進(jìn)一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明不限于實(shí)施例。
[0051] 實(shí)施例1.花菁類化合物的制備：
[0052] 通式I中所示花菁類熒光團(tuán)來自市售商品，然后在熒光團(tuán)相應(yīng)的位置分別修飾上 不同的定位基團(tuán)。最后將修飾定位基團(tuán)的熒光團(tuán)和取代苯甲酸在二氯甲烷溶劑中反應(yīng)得到 的相應(yīng)的花菁類化合物。具體實(shí)施例如下：
[0053] 制備式一化合物：
[0054] 在氦氣保護(hù)下，2, 2' -二硫代二苯甲酸（I. 53g, 5mmol)和草酰氯 (2. 96g，23. 3mmol)于100mL二氯甲烷中，冰水浴下反應(yīng)3小時(shí)，蒸干溶劑待用。冰水浴下， 將花菁熒光團(tuán)（500mg，I. 08mmol)溶于二氯甲烷中，然后滴加2, 2' -二硫代二苯甲酰氯，冰 浴下反應(yīng)1小時(shí)后水洗至中性，然后二氯甲烷（100ml X 3)萃取，蒸干溶劑后，將粗產(chǎn)品溶 于50ml乙醇，冰水浴下分批滴加硼氫化鈉（g，mol)，反應(yīng)持續(xù)15分鐘后以稀鹽酸（10%) 中和至中性，然后二氯甲烷（l〇〇ml><3)萃取，加硫酸鈉干燥，蒸干溶劑后用硅膠柱色譜 (200-300目）分離。洗脫劑為二氯甲烷和石油醚（l:l/v/v)，收集黃色組分，蒸干溶劑后得 得產(chǎn)品0. 51g，收率：75%。
[0055] 式一化合物：? NMR (500MHz，CDCl3-D1) δ (ppm) : 1. 12-1. 47 (m，14H)，1. 79 (s，6H)， 2· 60-2. 86 (t，8H)，3· 43 (s，1H)，4· 48 (s，1H)，5· 34-5. 54 (m，3H)，6· 08 (s，1H)，6· 51-6. 80 (m, 4Η)，7· 01-7. 61 (m，7Η). LC-MS(API-ES) :m/z C41H46N2O2S Calcd630. 3280, found[M-l] 629. 3 208.
[0056]