一種需氧菌或兼性需氧菌的簡易批量培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵領(lǐng)域，具體設(shè)及一種需氧菌或兼性需氧菌的簡易批量培養(yǎng) 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 發(fā)酵是指人們借助微生物在有氧或無氧條件下的生命活動來制備微生物菌體本 身、或者直接代謝產(chǎn)物或次級代謝產(chǎn)物的過程(邱立友，王明道主編.微生物學：化學工 業(yè)出版社，2012 :343)。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，在微生物發(fā)酵領(lǐng)域?qū)π柩蹙蚣嫘孕?氧菌的純培養(yǎng)需求日益增多，目前，需氧菌或兼性需氧菌的實驗室培養(yǎng)是一種常見、簡單、 成熟技術(shù)，如液體、固體培養(yǎng)；試管、平皿、茄形瓶培養(yǎng)等，但大批量生產(chǎn)制備，其工藝難度較 大。在大批量需氧菌或兼性需氧菌的純培養(yǎng)發(fā)酵領(lǐng)域，多采用傳統(tǒng)的發(fā)酵罐液體通氣培養(yǎng) 方法，該方法普遍存在生產(chǎn)環(huán)節(jié)易污染、生產(chǎn)效率較低、菌液濃縮困難、污水排放多及生產(chǎn) 成本高等瓶頸。
[0003]密封箱體多層固體發(fā)酵培養(yǎng)方法，其設(shè)備簡單、成本低廉、操作方便、不易污染、生 產(chǎn)效率高；該技術(shù)的應用可顯著降低培養(yǎng)基的用量，節(jié)約產(chǎn)品濃縮成本，降低能耗，減少污 水排放。與傳統(tǒng)發(fā)酵罐液體發(fā)酵培養(yǎng)方法相比，其培養(yǎng)效率可提高50倍W上，細菌濃度可 高達1500 -2000億個/ml,降低生產(chǎn)成本50%W上。
[0004]經(jīng)百度捜索引擎、維普中文科技期刊數(shù)據(jù)庫等捜索"固體平面發(fā)酵"、"固體平面培 養(yǎng)"、"多層方盤發(fā)酵培養(yǎng)"等詞匯，均未查閱到相同或相近的內(nèi)容?，F(xiàn)行的微生物固體發(fā)酵 培養(yǎng)，是在本領(lǐng)域廣泛應用的傳統(tǒng)技術(shù)、方法，其工藝特征在于混菌發(fā)酵培養(yǎng)，即微生物與 固體培養(yǎng)基顆粒混合在一起。本專利技術(shù)提供的密封箱體多層固體培養(yǎng)方法，工藝特征是 濃縮純培養(yǎng)，即單一細菌的純化培養(yǎng)。細菌的批量純化培養(yǎng)在許多生物技術(shù)領(lǐng)域如菌種生 產(chǎn)、疫苗生產(chǎn)、微生態(tài)制劑和生物酶制劑生產(chǎn)等都有著廣泛的技術(shù)需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于針對在需氧菌或兼性需氧菌的批量生產(chǎn)制備過程中普遍存在 生產(chǎn)效率低、菌液濃縮困難、污水排放多或生產(chǎn)成本高等瓶頸問題，提供一種需氧菌或兼性 需氧菌的簡易批量培養(yǎng)方法，該培養(yǎng)方法設(shè)備簡單、成本低廉、操作方便、不易污染、生產(chǎn)效 率高，與傳統(tǒng)發(fā)酵罐液體發(fā)酵培養(yǎng)方法相比，其培養(yǎng)效率可提高50倍W上，細菌濃度可高 達1500~2000億個/ml,降低生產(chǎn)成本50%W上。
[0006] 為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案： 一種需氧菌或兼性需氧菌的簡易批量培養(yǎng)方法，采用密封箱體多層方盤固體平面發(fā) 酵裝置培養(yǎng)；所述的密封箱體和方盤是W不易變形的耐熱薄板材質(zhì)制作，方盤的數(shù)量為 10~20個，密封箱體的大小W僅能容納指定數(shù)量層疊放置的方盤為準，密封蓋的對角處分別 設(shè)置2個直徑為22mm的接種孔，接種孔用硅膠塞密封；所述密封箱體開口處設(shè)有封閉開口 的密封蓋，所述密封蓋與箱體開口邊緣之間設(shè)有密封膠墊，所述密封蓋、密封膠墊及箱體經(jīng) 貫穿=者的鎖閉螺絲固定連接；鎖閉螺絲設(shè)置于密封蓋四角。
[0007] 所述的不易變形的耐熱薄板材質(zhì)是不誘鋼。
[0008] 每個方盤的尺寸根據(jù)生產(chǎn)需求進行設(shè)定，如根據(jù)生產(chǎn)需求設(shè)置為：長45cm~60cm; 寬 30cm~45cm;高 1. 5cm~2. 5cm。
[0009] 所述的需氧菌或兼性需氧菌的簡易批量培養(yǎng)方法，包括W下步驟：1)通過密封蓋 上預留的接種孔，注入按方盤內(nèi)表面積計算能形成厚度為3mm~5mm凝膠的瓊脂培養(yǎng)基混懸 液，用硅膠塞密封接種孔，置高溫滅菌設(shè)備中常規(guī)滅菌，待箱體溫度降至50°C~60°C，震蕩 箱體混勻培養(yǎng)基，W方盤位置為基準豎立箱體，靜置片刻使瓊膠從縫隙中流入方盤，待瓊膠 液面平衡穩(wěn)定，然后快速水平放置箱體并使方盤開口朝上，使融化的瓊脂均勻分布于每個 方盤中； 2) 待瓊脂降溫凝固，按箱體容積的P/c^2%接種液體菌種，接種采取無菌術(shù)式，借助超凈 工作臺或火焰封閉將菌種注入或滴入接種孔中，菌種濃度保持5億個/mlW上，接種后W方 盤位置為基準豎立箱體，靜置片刻使菌液從縫隙中流入方盤，待菌種液面平衡穩(wěn)定，然后快 速水平放置箱體并使方盤開口朝上，輕輕傾斜、往返震蕩箱體，使菌種充分涂布于瓊脂培養(yǎng) 基表面，置適溫條件下培養(yǎng)24h~72h形成菌苔； 3) 培養(yǎng)物收獲時按箱體容積的15°/c^20%注入沖洗液，震蕩箱體充分洗涂菌苔后傾斜箱 體，通過接種孔導出洗涂液即獲得濃縮純培養(yǎng)菌液。
[0010] 所述的需氧菌或兼性需氧菌的簡易批量培養(yǎng)方法，細菌在多層方盤固體培養(yǎng)基上 發(fā)酵培養(yǎng)，義用一次性注入培養(yǎng)基、一次性滅菌、一次性形成多層培養(yǎng)表面、一次性接種、一 次性洗涂收獲。
[0011] 為防止產(chǎn)品污染，通過無菌操作采用注射針頭、膠管連接和過濾空氣箱體內(nèi)增壓 的方法，將濃縮菌液導入容器中，獲得無污染的濃縮純培養(yǎng)菌液。
[0012] 箱體中殘留的培養(yǎng)基，通過加熱或高溫滅菌后，在培養(yǎng)基降溫凝固前通過接種孔 倒出，注水沖洗，將接種孔倒置、淋干備用。
[0013] 本發(fā)明是將實驗室中細菌的瓊脂平板培養(yǎng)方法進行有效放大。在實驗室常用的平 皿或茄形瓶瓊脂平板培養(yǎng)細菌的方法，因其有效培養(yǎng)面積較小，僅應用于小批量細菌培養(yǎng)， 不適用于細菌的大量生產(chǎn)制備。1個密封箱體多層方盤的有效培養(yǎng)面積約為30000cm2,相 當于200個規(guī)格為500ml茄形瓶的培養(yǎng)面積或468個直徑為9cm平皿的培養(yǎng)面積。密封 箱體多層方盤培養(yǎng)技術(shù)在大批量需氧菌或兼性需氧菌生產(chǎn)制備中具有顯著的應用優(yōu)勢。
[0014] 本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明的設(shè)備簡單、成本低廉、操作方便、不易污染、生產(chǎn) 效率高，與傳統(tǒng)發(fā)酵罐液體發(fā)酵培養(yǎng)方法相比，其培養(yǎng)效率可提高50倍W上，細菌濃度可 高達1500~2000億個/ml,降低生產(chǎn)成本50%W上；解決了在需氧菌或兼性需氧菌的批量生 產(chǎn)制備過程中普遍存在生產(chǎn)效率低、菌液濃縮困難、污水排放多或生產(chǎn)成本高等瓶頸問題。
【附圖說明】
[0015] 圖1為方盤的結(jié)構(gòu)示意圖； 圖2為密封培養(yǎng)箱部分分解結(jié)構(gòu)示意圖； 圖3為密封培養(yǎng)箱整體結(jié)構(gòu)分解結(jié)構(gòu)示意圖； 圖中，10-方盤，20-箱體，30-密封膠墊，40-密封蓋，410-鎖閉螺絲，50-接種孔。
【具體實施方式】
[0016] 本發(fā)明用下列實施例來進一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明的保護范圍并不限于下列實 施例。
[0017] 福建某動物微生態(tài)制劑廠，曾應用液體發(fā)酵罐通氣發(fā)酵方法生產(chǎn)大腸埃希氏菌 C600,生產(chǎn)工藝較為復雜，離屯、濃縮過程中的人工勞動繁重，易受雜菌污染，生產(chǎn)效率低下。 也曾改用茄形瓶營養(yǎng)瓊脂平面培養(yǎng)，顯著降低了原材料消耗，因其有效培養(yǎng)面積較小，人工 勞動繁重，操作環(huán)節(jié)繁瑣、污染機率高，生產(chǎn)效率受到限制。應用本發(fā)明的密封箱體多層方 盤固體平面發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)，設(shè)備簡單，投入少，生產(chǎn)工藝簡化，產(chǎn)品污染機會減少，降低了生 產(chǎn)成本，減少了污水排放，生產(chǎn)效率顯著提高，連續(xù)生產(chǎn)液體微生態(tài)制劑成品200余噸，取 得了良好的效益。
[0018] 現(xiàn)W生產(chǎn)10L濃度為1500億個/ml的大腸埃希氏菌（C600)濃縮菌液為例，對上 述=種培養(yǎng)方法進行比較如下： 實施例1液體發(fā)酵罐通氣培養(yǎng)發(fā)酵1)設(shè)備 500L發(fā)酵罐；超凈工作臺（1400X690X520mm);大容量冷凍離屯、機（Dk4000B，500mlX6)。
[001引。培養(yǎng)基制備 普通肉湯培養(yǎng)基：蛋白腺5kg、牛肉膏1.5kg、氯化鋼2. 5kg、蒸饋水500L(牛肉膏、 蛋白腺為北京奧博星生物公司生產(chǎn))。
[0020] 混勻培養(yǎng)基后，用10%氨氧化鋼調(diào)節(jié)至抑7. 4,發(fā)酵罐W121°C高壓滅菌15min,冷 卻備用（氯化鋼為市售分析純試劑)。
[0021] 3)接種培養(yǎng) 通過無菌術(shù)式接入大腸埃希氏菌C600菌種100ml，菌種濃度為5億個/ml，發(fā)酵罐底 部通入無菌超濾空氣，打開發(fā)酵罐頂部的無菌超濾排氣孔，37 °C通氣培養(yǎng)36h，細菌濃度 達到30億個/ml。
[002引 4)菌液濃縮 細菌培養(yǎng)液的分裝在超凈工作臺上進行，將培養(yǎng)菌液分別、多次導出至塑料離屯、瓶中，離屯、機每次離屯、容量為3000ml(500mix6)，密封離屯、瓶后，分別置于離屯、杯中、對角離屯、 杯平衡。4000巧m離屯、沉淀10min棄上清，取60ml滅菌生理鹽水依次洗涂6個離屯、瓶中 的沉淀物，獲得約60ml濃度為1500億個/ml的濃縮菌液。500L發(fā)酵培養(yǎng)菌液，共累計 離屯、167次，收集洗涂液，獲得約10L濃度為1500億個/ml的濃縮菌液。
[002引W主要設(shè)備投資、生產(chǎn)成本 設(shè)備：10.2萬元(發(fā)酵罐4.8萬元；超凈工作臺1.2萬元；大容量冷凍離 屯、機4.2萬）。
[0024]培養(yǎng)基：1480元(蛋白腺5kgX200元；牛肉膏1. 5kgX300元；氯化鋼 2. 5kgX12 元)。
[00巧]水電費：591元(滅菌15KVX3hXl元；培養(yǎng)1KVX36/2hXl元； 離屯、1KVX167/6hX1 元；蒸饋水 500LX1 元)。
[0026] 人員工資：800元（2人X2dX200元)。
[0027] 6)廢物排放 廢棄培養(yǎng)基500L;器具洗刷用水200L。
[0028] 實施例2茄形瓶營養(yǎng)瓊脂平面培養(yǎng) 1) 設(shè)備器材 邸式矩形壓力蒸汽滅菌器(規(guī)格：30L1018X500X600mm);恒溫培養(yǎng)箱（規(guī)格： 610X530X1360mm);超凈工作臺（規(guī)格：1400X690X520mm);大容量振蕩器；茄形瓶(規(guī) 格：500ml); 2) 培養(yǎng)基制備 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：蛋白腺0. 1kg;牛肉膏0. 03kg;氯化鋼0. 05kg;瓊脂0. 15kg;蒸 饋水10L。
[0029] 混勻培養(yǎng)基，用10%氨氧化鋼調(diào)節(jié)至抑7. 4,分裝至200個茄形瓶中，每瓶50ml, 用硅膠塞密封瓶口，置121 °C高壓滅菌15min,待溫度降至50°C~60°C，震蕩茄形瓶混勻培 養(yǎng)基，水平放置，待瓊脂降溫凝固，形成厚度為3mm~5mm營養(yǎng)瓊脂凝膠備用。
[0030] 3)接種培養(yǎng) 借助超凈工作臺，通過無菌術(shù)式，每個茄形瓶接入大腸埃希氏菌C600菌種3ml，菌種 濃度為5億個/ml,硅膠塞密封瓶口。傾斜、搖動茄形瓶，使菌種充分涂布于瓊脂培養(yǎng)基表 面，置37 °C培養(yǎng)36h，待菌種生長形成菌苔。
[0031] 4)菌液收集 通過無菌術(shù)式每個茄形瓶注入滅菌生