一種利用低溫冷凍環(huán)境從抗菌脂肽溶液中除鹽的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種利用低溫冷凍環(huán)境從抗菌脂肽溶液中除鹽的方法，屬于抗菌肽純 化技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 抗菌脂肽（antimicrobialIipopeptide)是抗菌肽（antimicrobialpeptide)的 一種，一般是革蘭氏陽性桿菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物?？咕牡姆肿佑捎H水的肽鍵和親油的脂 肪烴鏈兩部分組成，由于其特殊的化學(xué)組成和兩親型分子結(jié)構(gòu)，抗菌脂肽除了抗菌活性之 外還具有表面活性劑的特性。在生物醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、石油開采、食品及化妝品和環(huán)境治理等領(lǐng) 域，抗菌脂肽有著重要的應(yīng)用前景，已引起廣泛的關(guān)注。
[0003] 目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的抗菌脂肽主要有表面活性素（surfactin)、芬介素（fengycin)、 伊枯草菌素（iturins)、桿菌霉素（bacillomycin)、抗霉枯草菌素（mycosubtilin)、制磷脂 菌素（plipstatin)等。
[0004] 解淀粉芽孢桿菌的發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)過酸沉、乙醇萃取和脫鹽、水相置換等濃縮純化 操作，使用液質(zhì)聯(lián)用檢測，發(fā)現(xiàn)分子量為994Da、1008Da、1022Da、1036Da，與目前文獻(xiàn)報(bào)道 的表面活性素的分子量相吻合，經(jīng)鑒定，解淀粉芽孢桿菌表達(dá)的抗菌脂肽為表面活性素 (surfactin)〇
[0005] 表面活性素，由P_羥基脂肪酸和7個(gè)氨基酸殘基的小肽組成，肽鏈的第7位氨基 酸上的羧基和脂肪酸的P_羥基縮合形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。肽鏈中典型的氨基酸組成順序?yàn)椋↙-) Glu- (L-)Leu-(D-)Leu- (L-)Val- (L-)Asp-(D-)Leu- (L-)Leu，其分子結(jié)構(gòu)式如下：
[0006]
[0007] 從該分子結(jié)構(gòu)式中可以看出，氨基酸組分包含中性的亮氨酸、纈氨酸和酸性的谷 氨酸、天冬氨酸，在發(fā)酵過程中生成的主要是谷氨酸和天冬氨酸的鉀鹽形式，因此該物質(zhì)的 分泌使得發(fā)酵過程中PH升高。
[0008]目前抗菌肽方面主要的研究重點(diǎn)均集中于以下三個(gè)方面：
[0009] 1、各類抗菌肽基因的構(gòu)建、電轉(zhuǎn)、鑒定和篩選的分子生物學(xué)過程；
[0010] 2、抗菌肽的人工化學(xué)合成以及天然抗菌肽的化學(xué)提取法；
[0011] 3、抗菌肽作為殺蟲劑、飼料添加劑以及各類昆蟲抗菌肽的有效成分的深加工和應(yīng) 用。鮮有報(bào)道抗菌脂肽濃縮純化和脫鹽的專利。至今，國內(nèi)沒有抗菌脂肽表面活性素發(fā)酵 液適合中試、大規(guī)模的微濾用膜、低溫脫鹽的發(fā)酵下游后處理方法。
[0012] 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)的陸兆新、艾嘉等人使用高壓液相建立了一套準(zhǔn)確可信的檢測抗菌 脂肽的方法，在制備較純的標(biāo)準(zhǔn)品過程中，對提取方法進(jìn)行了優(yōu)化，如圖7所示。
[0013] 但上述方法僅適用于實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證，存在無法大規(guī)模應(yīng)用、有機(jī)溶劑毒性較大的問 題，并且，由于抽提過程中不可避免摻入了少量水，鹽的存在使得抗菌脂肽在儲(chǔ)存過程中更 容易水解，在向其他有機(jī)相轉(zhuǎn)換過程中容易出現(xiàn)結(jié)晶沉淀；在定性檢測時(shí)有脫尾峰現(xiàn)象，從 而最終廣品純度不尚。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014] 本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種利用低溫冷凍環(huán)境從抗菌脂肽的有機(jī)溶液 中脫鹽的方法。
[0015] 發(fā)明概述
[0016] 本發(fā)明對發(fā)酵液依次進(jìn)行的后處理操作為：板框澄清一酸沉沉降，虹吸一離心壓 實(shí)沉降物一萃取抽提一有機(jī)膜微濾一低溫冷凍鹽析一保留液體，去除鹽結(jié)晶一無菌有機(jī)膜 微濾。以上操作中，控制萃取抽提操作中的無水乙醇的體積用量，達(dá)到濃縮目的。根據(jù)酸沉 物組分在乙醇和水中溶解度的不同，使用乙醇萃取抽提達(dá)到了純化目的。在低溫冷凍環(huán)境 長期存放的過程中，原先存留在離心沉降濕物質(zhì)中的無機(jī)鹽類逐漸析出，停留在容器底部， 很容易去除。本發(fā)明采取的后處理操作容易適應(yīng)大規(guī)模中試甚至生產(chǎn)的需求，操作技術(shù)難 度低，通過正規(guī)培訓(xùn)容易掌握操作技能，通過處理后的濃縮純化液在冷凍和冷藏環(huán)境中不 結(jié)冰，保持清澈狀態(tài)，可以根據(jù)生產(chǎn)需要置換溶劑或進(jìn)行稀釋。
[0017] 發(fā)明詳述
[0018] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0019] -種利用低溫冷凍環(huán)境從抗菌脂肽溶液中除鹽的方法，其特征在于，包括如下步 驟：
[0020] (1)將解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵制備抗菌脂肽后得到的發(fā)酵液經(jīng)過濾，去除菌體，制得 澄清液；
[0021] (2)向步驟⑴制得的澄清液中流加稀鹽酸至pH值為1. 8~2. 5,室溫靜置16小 時(shí)以上，棄上清液，制得漿狀流體；
[0022] (3)向步驟⑵制得的漿狀流體中加入萃取劑，萃取劑的加入量為步驟⑴中發(fā)酵 液體積的5%~10%，攪拌均勻，0~20°C萃取3~5小時(shí)，離心后，經(jīng)0. 22微米的有機(jī)膜 微濾，制得濾液；
[0023] 所述的萃取劑為無水乙醇或植物油；
[0024] (4)將步驟⑶制得的濾液在-25~-KTC的條件下放置5~10天進(jìn)行結(jié)晶，經(jīng) 0. 22微米的有機(jī)膜微濾過濾去除結(jié)晶，制得抗菌脂肽溶液。
[0025] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（1)中的過濾為80~200目濾布的板框過濾；進(jìn)一 步優(yōu)選的，所述的板框過濾的濾布為預(yù)涂硅藻土的濾布，硅藻土的涂布量為每百升發(fā)酵液 0. 8 ~I. 5kg。
[0026] 該操作可以一次性去除99%的菌體濕重，5平方米的100目的濾布可以達(dá)到的平 均濾速為200升/小時(shí)。
[0027] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（2)中還包括對漿狀流體進(jìn)行離心，去除上清留沉 淀，得到固形物濕重10~20g/L(漿狀流體）的步驟。
[0028] -般情況下，酸沉物可以自動(dòng)壓實(shí)到酸沉體系的10 %~20 %體積，該過程大大降 低了后續(xù)離心操作的勞動(dòng)強(qiáng)度。
[0029] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（2)中流加稀鹽酸為在攪拌條件下進(jìn)行，稀鹽酸的 速度為每升澄清液每分鐘流加〇. 4~0. 8mol的鹽酸。
[0030] 由于該發(fā)酵液具有一定的緩沖能力，因此要緩慢流加，充分?jǐn)嚢?，該pH環(huán)境使得 期間該菌的發(fā)酵活性受到抑制，同時(shí)也降低了其他雜菌污染的可能性。
[0031] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（3)中的無水乙醇為食品級(jí)無水乙醇；植物油為大 豆油、花生油、山茶油、棉籽油。
[0032] 該萃取步驟使用的是無水乙醇，否則會(huì)在萃取過程中造成乙醇進(jìn)一步被稀釋，在 使用有機(jī)相濾膜聚醚砜（PES)時(shí)會(huì)造成過濾阻力變大。經(jīng)無水乙醇充分萃取后，漿狀流體 中的組分發(fā)生了轉(zhuǎn)移，一方面，濕物質(zhì)中約55% (m/m)是水分，該水分溶解在無水乙醇中， 剩余的45% (m/m)固形物質(zhì)中，抗菌脂肽約占60%~70%抗菌脂肽物質(zhì)，該部分物質(zhì)也溶 解在乙醇中，剩下的物質(zhì)是水溶的，乙醇不溶解的，經(jīng)檢測沒有活性的物質(zhì)，該步驟通過控 制無水乙醇的用量，起到了濃縮作用。
[0033] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（3)和步驟（4)中的有機(jī)膜為聚醚砜（PES)有機(jī)膜。
[0034] 聚醚砜（PES)有機(jī)膜不容易被乙醇溶蝕，植物油不存在該問題。
[0035] 步驟（4)中結(jié)晶時(shí)間要足夠長，使得其中的硫酸鎂、磷酸二氫鉀和氯化鉀充分析 出，這也是純化步驟，主要是除鹽。0. 22微米的有機(jī)膜微濾的主要目的是除菌。
[0036] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（1)中，發(fā)酵液采用如下方法制備：
[0037] ⑴將發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后，調(diào)節(jié)溫度至25~28°C，在通氣量為lvvm、攪拌速度為 200rpm的條件下，標(biāo)定溶氧的相對百分點(diǎn)；
[0038] 所述發(fā)酵培養(yǎng)基組分如下：
[0039] 葡萄糖15~25g/L，L-谷氨酸鈉5~14g/L，硫酸鎂0? 5g/L，磷酸二氫鉀lg/L，氯 化鉀0? 5g/L，硫酸亞鐵0? 15mg/L，硫酸猛5mg/L，硫酸銅0? 16mg/L;
[0040] (ii)將解淀粉芽孢桿菌種子液接種于步驟（i)標(biāo)定溶氧的相對百分點(diǎn)后的發(fā)酵 培養(yǎng)基中，在溫度25~28°C、通氣量為lvvm、攪拌速度為200rpm的條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)， 標(biāo)定初始pH值，并標(biāo)記為發(fā)酵起始零點(diǎn)；
[0041] (iii)當(dāng)發(fā)酵過程中pH值較初始pH值升高大于1. 2時(shí)，或者當(dāng)發(fā)酵過程中pH值 較初始pH值升高大于1且在1小時(shí)內(nèi)pH值升高幅度小于0. 2時(shí)，結(jié)束發(fā)酵。
[0042] 發(fā)明人發(fā)現(xiàn)該細(xì)菌分泌的目標(biāo)產(chǎn)物抗菌脂肽是有機(jī)弱酸鹽，在水基環(huán)境中顯示堿 性，因此在發(fā)酵過程中，pH值會(huì)持續(xù)升高，采用pH增幅判斷發(fā)酵終點(diǎn)，使發(fā)酵終點(diǎn)控制更加 精確；
[0043] 根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的，所述步驟（ii)中的接種量為1%~2% (體積百分 比）。
[0044] 根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的，所述步驟（ii)中的解淀粉芽孢桿菌種子液，制備步驟 如下：
[0045] a、將解淀粉芽孢桿菌接種于PDA固體培養(yǎng)基中，在溫度至25~28°C的條件下，活 化1-2天，制得活化后的解淀粉芽孢桿菌；
[0046] b、將步驟a制得的活化后的解淀粉芽孢桿菌接種于種子液培養(yǎng)基中，在溫度至 25~28°C的條件下，培養(yǎng)18~24小時(shí)，制得解淀粉芽孢桿菌種子液；
[0047] 所述種子液培養(yǎng)基組分如下：
[0048] 葡萄糖20g/L，酵母浸粉5~10g/L，蛋白胨10~20g/L，氯化鈉5~10g/L。
[0049] 有益效果
[0050] 1、本發(fā)明首次公開了低溫冷凍環(huán)境儲(chǔ)存環(huán)境條件下，萃取體系中的無機(jī)鹽可以充 分析出，析出微濾后的有機(jī)溶液再次低溫冷凍儲(chǔ)存時(shí)不會(huì)再發(fā)生結(jié)晶現(xiàn)象，可以解決目前 抗菌脂肽制備過程中雜