一種能夠治療癌癥的免疫球蛋白的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬生物領(lǐng)域，涉及一種能夠治療癌癥的免疫球蛋白。
【背景技術(shù)】
[0002] 胰腺癌是一種極其兇險的惡性腫瘤，其發(fā)病率及死亡率在全世界范圍內(nèi)均呈明顯 的上升趨勢，2008年胰腺癌分別占男性和女性癌癥死因的第4、第5位，其發(fā)病率和死亡率 幾乎相等。胰腺癌的診治是世界級的醫(yī)學(xué)難題，惡性程度高、進(jìn)展快、侵襲性強、轉(zhuǎn)移早、預(yù) 后極差，癥狀隱匿，難以早期診斷，其容易發(fā)生浸潤轉(zhuǎn)移的生物學(xué)行為和胰腺的解剖學(xué)特點 決定了外科手術(shù)難以達(dá)到根治性切除。隨著手術(shù)方式的改進(jìn)及放療、化療等綜合措施的引 進(jìn)，并發(fā)癥和死亡率有所降低，但五年生存率仍不到5%。胰腺癌作為一種對現(xiàn)有治療手段無 滿意療效的高度惡性腫瘤，尋找新的具有臨床應(yīng)用價值的胰腺癌治療手段如靶向治療是目 前研宄的熱點。
[0003] 人滋養(yǎng)層細(xì)胞表面抗原 2 (human trophoblast cell surface antigen 2， Trop-2)是由TACSTD2基因編碼的細(xì)胞表面糖蛋白。Trop-2由323個氨基酸構(gòu)成，其中信號 肽26個氨基酸，胞外區(qū)248個氨基酸，跨膜區(qū)23個氨基酸，胞質(zhì)區(qū)26個氨基酸。大量臨床研 宄和文獻(xiàn)報道表明，Trop-2在胰腺癌、結(jié)腸癌、胃癌、肺癌、前列腺癌、子宮癌和胰腺癌等上 皮癌中過表達(dá)，而在成年人正常組織中很少表達(dá)或不表達(dá)；Trop-2在腫瘤組織中的過表達(dá) 與患者的預(yù)后不良和癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，同時影響患者的總生存率。因此，Tr〇p-2 已成為腫瘤分子靶向治療中引人注目的靶標(biāo)。
[0004] 現(xiàn)有技術(shù)中已有Tr 0 P-2的抗體，但是其效果并不是特別良好，還有一定的改 進(jìn)空間，使其治療的效果更好。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供一種人源抗Trop-2基因工程抗體IgG，所述抗體的VL鏈的互補決定區(qū) ⑶R為以下的⑶R氨基酸序列： SEQ ID NO. 1 或 2 或 3 所示的 L-CDRl ; SEQ ID NO. 4 或 5 所示的 L-CDR2 ; SEQIDN0·6或7或所示的L-CDR3; 并且所述抗體的Vh鏈的互補決定區(qū)CDR為以下的CDR氨基酸序列： SEQ ID NO. 8 或 9 或 10 所示的 H-CDRl ; SEQ ID MX 11 所示的 H-CDR2 ; SEQ ID NO. 12 或 13 所示的 H-CDR3。
[0006] 本發(fā)明的人源抗Trop-2基因工程抗體IgG可以用于制備治療胰腺癌藥物中的應(yīng) 用。
[0007] 有益效果：本發(fā)明人對已知的Trop-2的特異性人源Fab抗體進(jìn)行了相應(yīng)的改造， 通過了眾多的嘗試，去掉了不具有功能的改進(jìn)，獲得了 14個具有功能的改造后的能夠治療 治療胰腺癌的免疫球蛋白。
【具體實施方式】
[0008] 實施例1改造的治療胰腺癌的免疫球蛋白的獲得 根據(jù)CN102827282A中公開的抗Trop-2抗體IgG的輕鏈和重鏈序列6和13的序列，通 過核苷酸合成的方式分別獲得相應(yīng)的抗Trop-2抗體IgG的輕鏈和重鏈序列，通過本領(lǐng)域常 規(guī)的蛋白表達(dá)方式，獲得了相應(yīng)的抗體，命名為Trop-2 b抗體。
[0009] 根據(jù)輕鏈和重鏈的6個⑶R區(qū)域的氨基酸改造，分別獲得接近接近50種不同的抗 體變形體，通過活性的篩選，得到了 16種抗癌效果較好的抗體類型，其CDR序列分別如下： VL :CDR1 :SEQ ID NO :1 :GlnPheIIeSerGlyTyr;或SEQ ID NO :2 :GlnPheIIeSerAsnTyr; CDR2: SEQ ID N0:3:AlaSerSer; CDR3: SEQ ID N0:4:GlnGlnSerTyrSerThrAsnPheThr; VH:CDR1:SEQ ID N0:5:GlyPheThrPheIleSerTyrGly;或 SEQ ID N0:6: GlyPheSerPheSerSerTyrGly ； CDR2 ：SEQ ID NO ： 7 ： SerTrpTyrAspGlySerAsnLys ; 或 SEQ ID NO :8: IleTrpTyrProGlySerAsnLys; CDR9: SEQ ID N0:9:AlaArgAspProGlyTrpGlySerAspTyr;或 SEQ ID N0:10:AlaArgA spProGlyTrpGlySerAspIle; 其中Trop-2 c抗體的6個CDR序列分別為：SEQ ID N0:l、3、4、5、7、9。
[0010] 其中 Trop-2 d 抗體的 6 個 CDR 序列分別為：SEQ ID NO :1、3、4、5、7、10。
[0011] 其中 Trop-2e 抗體的 6 個 CDR 序列分別為：SEQ ID NO :1、3、4、5、8、9。
[0012] 其中 Trop-2f 抗體的 6 個 CDR 序列分別為：SEQ ID NO :1、3、4、5、8、10。
[0013] 其中 Trop-2 g 抗體的 6 個 CDR 序列分別為：SEQ ID NO :1、3、4、6、7、9。
[0014] 其中 Trop-2 h 抗體的 6 個 CDR 序列分別為：SEQ ID NO :1、3、4、6、7、10。
[0015] 其中 Trop-2 i 抗體的 6 個 CDR 序列分別為：SEQ ID NO :1、3、4、6、8、9。
[0016] 其中 Trop-2 j 抗體的 6 個 CDR 序列分別為：SEQ ID NO :1、3、4、6、8、10。
[0017] 其中 Trop-2k 抗體的 6 個 CDR 序列分別為：SEQ ID NO :2、3、4、5、7、9。
[0018] 其中 Trop-2 1 抗體的 6 個 CDR 序列分別為：SEQ ID NO :2、3、4、5、7、10。
[0019] 其中 Trop-2 m 抗體的 6 個 CDR 序列分別為：SEQ ID NO :2、3、4、5、8、9。
[0020] 其中 Trop-2 η 抗體的 6 個 CDR 序列分別為：SEQ ID NO :2、3、4、5、8、10。
[0021] 其中 Trop-2 〇 抗體的 6 個 CDR 序列分別為：SEQ ID NO :2、3、4、6、7、9。
[0022] 其中 Trop-2 p 抗體的 6 個 CDR 序列分別為：SEQ ID NO :2、3、4、6、7、10。
[0023] 其中 Trop_2q 抗體的 6 個 CDR 序列分別為：SEQ ID NO :2、3、4、6、8、9。
[0024] 其中 Trop-2 r 抗體的 6 個 CDR 序列分別為：SEQ ID NO :2、3、4、6、8、10。
[0025] 實施例2具有抗原識別特異性的全人源抗Trop-2抗體IgG的鑒定 根據(jù)CN102827282A中公開的方法，將本發(fā)明獲得IgG抗體能夠與Trop-2陽性細(xì)胞 BXPC3特異性結(jié)合，但不結(jié)合未表達(dá)Trop-2的NIH3T3細(xì)胞。說明本發(fā)明制備的抗體具有較 好的特異性。
[0026] 實施例3抗Trop-2抗體IgG對胰腺癌細(xì)胞BXPC3增殖的影響 以DMEM培養(yǎng)液稀釋抗Trop-2 IgG抗體，配制濃度為160mg/mL濃度的抗體，分別加 入培養(yǎng)有BxPC3細(xì)胞和NIH3T3細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)3天，MTS/PMS法檢測細(xì)胞的增 殖。MTS/PMS檢測結(jié)果顯示，抗體對未表達(dá)Trop-2的NIH3T3細(xì)胞增殖的抑制未見顯著的 變化，抗Trop-2抗體IgG與BXPC3細(xì)胞共同培養(yǎng)，抗體對細(xì)胞生長具有較強的的抑制作用。 結(jié)果如下：
實施例4抗Trop-2抗體IgG在動物模型中對胰腺癌細(xì)胞增殖的抑制 收集處于對數(shù)生長期的BxPC3細(xì)胞，用PBS洗2次，制成PBS制備成I X IOVmL細(xì)胞 懸液，按0.1 mL/只的量將細(xì)胞懸液接種于裸小鼠右側(cè)腋窩皮下，裸小鼠移植瘤用游標(biāo)卡尺 測量移植瘤直徑，待腫瘤生長至50-100_3后將動物隨機分組，每組8只。分別為空白對照 組、陰性對照組（抗RV IgG)和實驗組（10mg/kg、2mg/kg和(X4mg/kg 3個藥物梯度），每 組8只。每2天尾靜脈注射，共注射8次藥物。給藥結(jié)束后，剝離小鼠體內(nèi)的腫瘤，按照公 式V=l/2ab2計算腫瘤體積，分析抗體對裸鼠異種移植腫瘤生長的影響。結(jié)果顯示，靜脈給 藥結(jié)束后，空白對照組和陰性對照組之間腫瘤大小無顯著差異（P>〇. 05)，而實驗組中高濃 度組（10mg/kg)的腫瘤的體積顯著小于空白對照組和陰性對照組（P〈0. 01)，隨著給藥時間 的延長，腫瘤生長的抑制作用顯著增加，最終20天后，腫瘤的每組最好抑制率結(jié)果如下：
從以上結(jié)果可以看出，本發(fā)明提供的抗體具有較好的抑制癌癥的效果。而針對其他位 點進(jìn)行的改變，其效果并不突出，或者完全沒有抑制腫瘤生長的作用，在此，申請人不一一 列舉。
【主權(quán)項】
1. 一種免疫球蛋白，其特征在于：能夠治療胰腺癌。2. 如權(quán)利要求1所述的免疫球蛋白，其特征在于：其中免疫球蛋白的6個CDR序列按照 L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3、H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3 的順序依次為：SEQ ID N0:l、3、4、5、7、9 或5￡〇10吣：1、3、4、5、7、10或5￡〇10吣 ：1、3、4、5、8、9或5￡〇10吣：1、3、4、5、8、10或 5￡0 1〇勵：1、3、4、6、7、9或5￡0 1〇勵：1、3、4、6、7、10或5￡0 1〇勵：1、3、4、6、8、9或5￡0 10勵：1、3、4、6、8、10或5￡〇10勵：2、3、4、5、7、9或5￡〇10勵：2、3、4、5、7、10或5￡〇10 N0:2、3、4、5、8、9 或 SEQ ID N0:2、3、4、5、8、10 或 SEQ ID N0:2、3、4、6、7、9 或 SEQ ID NO: 2、3、4、6、7、10 或 SEQ ID N0:2、3、4、6、8、9 或 SEQ ID N0:2、3、4、6、8、10。3. 權(quán)利要求1-2所述的免疫球蛋白在制備治療胰腺癌的藥物中的應(yīng)用。4. 權(quán)利要求1-2所述的免疫球蛋白在治療胰腺癌中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明一種能夠治療癌癥的免疫球蛋白，具體涉及一種人源抗Trop-2基因工程抗體IgG及其在治療胰腺癌中的應(yīng)用，人源抗Trop-2基因工程抗體IgG的CDR序列如 SEQ ID NO.1-10所示的氨基酸序列。體外試驗結(jié)果表明，抗Trop-2抗體IgG對胰腺癌細(xì)胞的增殖具有顯著的抑制作用，小鼠體內(nèi)實驗也證明了其同樣具有較好的作用。具有較好的應(yīng)用前景以及應(yīng)用價值。
【IPC分類】C07K16/30, A61P35/00, A61K39/395
【公開號】CN104974254
【申請?zhí)枴緾N201510480784
【發(fā)明人】張玲
【申請人】張玲
【公開日】2015年10月14日
【申請日】2015年8月9日