一種抗柑橘潰瘍病菌的雙氮養(yǎng)弧菌菌株的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種抗柑橘潰瘍病菌的雙氮養(yǎng)弧菌菌株，具體涉 及一種雙氮養(yǎng)弧菌（Vibriodiazotrophicus)T24菌株，同時還涉及該菌株T24在防治柑橘 潰瘍病菌方面的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 柑橘是一種亞熱帶常綠果樹品種，其產(chǎn)量和種植面積在全球的水果當(dāng)中位列第 一，分布于熱帶和亞熱帶一些氣候適宜的國家和地區(qū)。從柑橘產(chǎn)量上來看，北半球幾乎占據(jù) 了一半的產(chǎn)出量，而南半球則占據(jù)了大約32%的供應(yīng)量，其余的部分是來自于地中海沿岸。 熱帶和亞熱帶區(qū)域，發(fā)展中國家的產(chǎn)量占到總產(chǎn)額的65%。2007年，在柑橘生產(chǎn)大國巴西 和美國等一些國家的帶領(lǐng)下，全球的柑橘產(chǎn)量以及栽培面積分別達(dá)到1. 2億噸和832萬公 頃，總量占全球水果總產(chǎn)量的20%，其貿(mào)易額和產(chǎn)量僅次于玉米和小麥，成為世界第三大貿(mào) 易農(nóng)廣品。
[0003] 柑橘栽培在中國已經(jīng)擁有幾千年的歷史，不僅栽培面積廣，而且種植的品種非常 多。在我國的福建、廣東、廣西、云南、湖南等一些南方城市大多都大面積的種植著橙類（如 紐荷爾、朋娜等）、寬皮桔類、柚類（如沙田柚、葡萄柚等）等品種。尤其是近幾年來中國的 柑橘產(chǎn)業(yè)迎來跨越式的發(fā)展，已經(jīng)成為柑橘產(chǎn)量位居世界第一的生產(chǎn)大國。
[0004] 在享受柑橘產(chǎn)業(yè)輝煌發(fā)展的成果的同時，我們也應(yīng)該重視柑橘生產(chǎn)過程中遇到的 影響柑橘產(chǎn)量和品質(zhì)的一些生物方面和非生物方面的因素，并且要采取相應(yīng)的積極防御的 措施。蟲害和病害是植物種植過程中遇到的最多的問題，也是影響收成的或大或小的威 脅因子，如柑橘種植中有一種被農(nóng)業(yè)部列入檢疫性有害生物名錄的重要病害，也是全球的 檢疫對象的對柑橘產(chǎn)業(yè)具有毀滅性影響的三大病害之一，即由Xanthomonasaxonopodis pv.Citri引起的柑橘潰瘍?。–itrusbacterialcankerdisease)。該病不僅影響著柑橘 的品質(zhì)，更是大大的影響著柑橘的產(chǎn)量，成為柑橘種植中的一個世界性難題。
[0005] 隨著社會的發(fā)展進(jìn)步，市場需求的逐漸擴大，以及競爭壓力地不斷增加，柑橘產(chǎn)業(yè) 得以迅猛發(fā)展。但由于對一些感病品種的栽培缺乏行之有效地管理，柑橘病害的嚴(yán)重性逐 漸遞增也隨之成為一種必然的趨勢，如何及時采取合理有效的措施進(jìn)行管理與防治，對推 進(jìn)柑橘種植這一支柱性產(chǎn)業(yè)具有非常重大和深遠(yuǎn)的意義。以往防治柑橘潰瘍病大都采用化 學(xué)方法為主，近年來，生物防治因其各方面的優(yōu)勢受到大家的關(guān)注，研宄生物防治的學(xué)者越 來越多，利用生物防治的方法來對付柑橘潰瘍病具有很大的潛力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種雙氮養(yǎng)弧菌（Vibriodiazotrophicus)T24菌株，為柑橘 潰瘍病菌的生物防治提供新的微生物資源。
[0007] 本發(fā)明所述的雙氮養(yǎng)弧菌T24(Vibriodiazotrophicus)T24菌株，已于2015年4 月10日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏單位地址：中國武漢武漢大學(xué)，保藏編號為 CCTCCNO：M2015221〇
[0008] 本發(fā)明菌株T24的特性：
[0009] 1、培養(yǎng)學(xué)方面的特性
[0010] 本發(fā)明的菌株T24于30°C在LB平板上呈乳白色不透明菌落，無光澤，邊緣不規(guī)則， 菌落看上去比較干燥平坦，正面沒有突起，見圖1。
[0011] 2、形態(tài)學(xué)方面的特性
[0012] 菌體為革蘭氏染色陰性，有鞭毛（圖2)，無莢膜，無芽孢，菌體呈細(xì)長的桿狀。
[0013] 3、生理生化特征
[0014] 淀粉水解：陰性；纖維素分解：陰性；甲基紅（M.R.):陽性；乙酰甲基甲醇（V.P.): 陽性；過氧化氫酶：陰性；明膠液化：陽性；產(chǎn)硫化氫：陰性；硝酸鹽還原：陽性；D引哚：陰 性。
[0015] 本發(fā)明菌株T24的鑒定：
[0016] 1、本發(fā)明菌株T24的Biolog鑒定
[0017] 采用的是快速鑒定微生物的Biolog微生物鑒定系統(tǒng)，具體步驟參照Biolog公司 的MicroLogTMSystem的指導(dǎo)手冊。
[0018]1)、平板選擇：針對菌株T24選擇BiologGN2板
[0019]樣品制備：將在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)好的菌株T24接種于Biolog接種液（GN/GP-IF)中，控制好適宜的濃度，使接種濁度為52%T;
[0020]2)、加樣：取一定體積的菌液（150ul/孔），平行加入BiologGN2板各孔中（共96 孔）；
[0021] 3)、培育與讀數(shù)：放置于30°C恒溫箱中恒溫培育4-6h，即可進(jìn)行第一次讀數(shù)， 16-24h可進(jìn)行第二次讀數(shù)，對于在4-6小時讀取的結(jié)果，SIM值必需多0. 75才是可以接受 的結(jié)果。在16-24小時培養(yǎng)后讀取結(jié)果時，SIM值必需多0.5才是可以接受的結(jié)果。本菌 株T24的鑒定結(jié)果如下表1:
[0022] 表1菌株T24的Biolog鑒定結(jié)果

[0024] 提取本發(fā)明菌株的細(xì)菌基因組DNA，16SrDNA片段采用通用引物27F/1492R進(jìn)行 PCR擴增，擴增片段由鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司測序，測得的序列于NCBI上進(jìn)行同源 性比較。結(jié)果顯示其16SrDNA序列與雙氮養(yǎng)弧菌同源性最高，達(dá)到99%以上。經(jīng)Biolog 檢測，本菌株T24與Vibriodiazotrophicus相似性為0. 548,遠(yuǎn)大于其它菌株相似度，符 合鑒定條件。通過形態(tài)觀察和ITS序列分子鑒定，確定本發(fā)明菌株為雙氮養(yǎng)弧菌（Vibrio diazotrophicus)的一新種，命名為雙氮養(yǎng)弧菌（Vibriodiazotrophicus)T24 菌株。
[0025] 將本發(fā)明菌株T24以4-5%接種重量接入LB液體培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)可制得發(fā)酵 液，發(fā)酵培養(yǎng)條件為：溫度28-37°C、pH6. 5-7. 5、時間24-36h及轉(zhuǎn)速180-200r/min，最佳發(fā) 酵培養(yǎng)條件為：溫度30°C、pH7.0、時間24h及轉(zhuǎn)速180r/min。該發(fā)酵液對柑橘潰瘍病菌 具有抑制作用，利用局部病斑法測得其無菌發(fā)酵液對柑橘潰瘍病菌體外抑制率達(dá)到90 %以 上。
[0026] 因此，本發(fā)明菌株T24能有效抑制柑橘潰瘍病菌，為柑橘潰瘍病菌的生物防治提 供新的微生物資源；且本發(fā)明通過生理生化檢測、Biolog微生物鑒定系統(tǒng)以及此菌16S rDNA序列分析均表明此菌為雙氮養(yǎng)弧菌中的成員，可以精確的將本發(fā)明的T24分類為雙氮 養(yǎng)弧菌，從而建立了分類鑒定微生物的一種快速（利用Biolog微生物鑒定系統(tǒng)，4-6h或 16-24h即可得到鑒定結(jié)果）、可靠、準(zhǔn)確的途徑。
【附圖說明】
[0027]圖1是本發(fā)明菌株T24的單菌落圖。
[0028] 圖2是本發(fā)明菌株T24的鞭毛圖。
[0029] 圖3為本發(fā)明菌株T24的抑菌圖。
[0030] 圖4為本發(fā)明菌株T24的發(fā)酵液對柑橘潰瘍病菌的拮抗效果圖。
[0031] 其中，A:噴有本發(fā)明菌株發(fā)酵液的葉片；B:清水處理的葉片（對照葉片）。
【具體實施方式】
[0032] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步地詳細(xì)說明。
[0033] 以下結(jié)合具體實施例對上述方案做進(jìn)一步說明。這些實施例是用于說明本發(fā)明而 不限于限制本發(fā)明的范圍。實施例中采用的實施條件可以根據(jù)廠家的條件做進(jìn)一步調(diào)整， 未注明的實施條件通常為常規(guī)實驗中的條件。
[0034] 實施例1本發(fā)明菌株T24的制備
[0035] 從湘西自治州龍山縣采集土樣，每種土樣取10g，分別加到裝有90ml無菌水（有玻 璃珠）的三角瓶中，震蕩lh，過濾去沉淀，將菌懸液依次稀釋成lO'lO'lO'lO'KT6。細(xì) 菌采用混勻法，真菌和放線菌采用涂沫法進(jìn)行分離。28°C下LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)48h，選取形 態(tài)、大小、色澤不同的菌落，進(jìn)行純化，斜面培養(yǎng)基保存。
[0036] 將柑桔潰瘍病菌制成菌液與融化的LB固體培養(yǎng)基混勻后倒入滅菌培養(yǎng)皿中，在 凝固的凝膠平板上打一孔，將分離得到的菌株分別制成一定濃度的菌懸液，用移液槍取lOOul菌液加到相應(yīng)平板的圓孔中，設(shè)3個平行。將標(biāo)記好的培養(yǎng)皿置于28°C的恒溫箱中， 每隔24h觀察一次抑菌圈的形成情況。選擇有拮抗效果的菌株用牛津杯法進(jìn)行復(fù)篩。
[0037] 實施例2本發(fā)明菌株T24對柑橘潰瘍病菌的室內(nèi)抑制作用
[0038] 將柑桔潰瘍病菌制成菌液與融化的LB固體培養(yǎng)基混勻后倒入滅菌培養(yǎng)皿中，在 凝固的凝膠平板上打一孔，將分離得到的T24菌株分別制成一定濃度的菌懸液，用移液槍 取100ul菌液加到相應(yīng)平板的圓孔中，設(shè)3個平行。將標(biāo)記好的培養(yǎng)皿置于30°C的恒溫箱 中，每隔24h觀察一次抑菌圈的形成情況。結(jié)果形成的抑菌圈直徑的平均值在45mm左右， 抑菌圈邊緣略微隆起，見圖3。
[0039] 實施例3本發(fā)明菌株T24用于柑橘活體上防治柑橘潰瘍病菌
[0040] 挑取本發(fā)明菌株T24接種到25mlLB液體培養(yǎng)基中，37°C，180r/min培養(yǎng)24h，得 到發(fā)酵液。選取生長狀況相似的柑橘樹3棵，每棵樹上選取生長發(fā)育程度相似的已完全展 開的新葉四片，用已滅菌的接種針將葉片上表皮刺破（每葉20孔），先用噴霧法將柑橘潰瘍 病菌噴于葉片上表面及下表面，Id后將制得的本發(fā)明菌株T24的發(fā)酵液噴于柑橘潰瘍病菌 處理過的每個處理組中的3片柑橘新葉作為處理，剩余的1葉為對照，對照葉片上不噴本發(fā) 明菌株的發(fā)酵液而噴清水，噴施本菌株T24發(fā)酵液一個月后觀察發(fā)病情況。每棵樹為一個 處理組，結(jié)果見下表2,結(jié)合參見圖4。
[0041] 結(jié)果顯示，3個處理組中對照（CK)均形成柑橘潰瘍病典型病斑，而噴施過本發(fā)明 菌株T24發(fā)酵液的葉片的病斑抑制率達(dá)到90%以上。
[0042] 表2本發(fā)明菌株T24發(fā)酵液對柑橘潰瘍病的抑制作用
【主權(quán)項】
1. 一種抗柑橘潰瘍病的雙氮養(yǎng)弧菌（Vibrio diazotrophicus) T24菌株，已于2015年 4月10日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC NO !M2015221。2. 如權(quán)利要求1所述的菌株在抑制柑橘潰瘍病菌中的應(yīng)用。3. 如權(quán)利要求1所述的菌株在防治柑橘潰瘍病菌中的應(yīng)用。4. 一種制備抗柑橘潰瘍病菌發(fā)酵液的方法，其特征在于，該方法是將權(quán)利要求1所述 的菌株以4-5 %接種量接入LB液體培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)。5. 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)條件為：溫度28-37°C、pH 6. 5-7. 5、時間 24-36h 及轉(zhuǎn)速 180-200r/min。6. 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)條件為：溫度30°C、pH 7. 0、時 間24h及轉(zhuǎn)速180r/min。7. 如權(quán)利要求4-6中任一項所述的發(fā)酵液在抑制柑橘潰瘍病菌中的應(yīng)用。8. 如權(quán)利要求4-6中任一項所述的發(fā)酵液在防治柑橘潰瘍病菌中的應(yīng)用。
【專利摘要】一種抗柑橘潰瘍病的雙氮養(yǎng)弧菌(Vibrio diazotrophicus)T24菌株，已于2015年4月10日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO：M2015221。本發(fā)明菌株T24的發(fā)酵液對柑橘潰瘍病菌具有抑制作用，利用針刺法測得其無菌發(fā)酵液對柑橘潰瘍病菌體外抑制率達(dá)到90％以上。CCTCC NO：M201522120150410
【IPC分類】A01N63/02, A01P1/00, C12R1/01, C12N1/20
【公開號】CN104962497
【申請?zhí)枴緾N201510410134
【發(fā)明人】唐前君, 周志成, 肖啟明, 戴良英, 李迅, 劉雙清, 李魏
【申請人】湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年10月7日
【申請日】2015年7月14日