一種番茄潰瘍病菌快速檢測(cè)的方法及其專用引物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及一種快速檢測(cè)番茄潰瘍病菌的方法及其專用引物。
【背景技術(shù)】
[0002]番爺潰瘍病(Bacterialcanker of tomato)是番爺{Lycopersicon esculenturnMill.)生產(chǎn)中最為嚴(yán)重的病害之一，該病自從1909年首次在美國(guó)密執(zhí)安州的溫室番茄上發(fā)現(xiàn)以來，現(xiàn)已廣泛分布于美國(guó)各番茄產(chǎn)區(qū)，并逐漸成為世界性病害。目前，在美洲、歐洲、亞洲、非洲和大洋洲的60多個(gè)國(guó)家都有番爺潰瘍病發(fā)生危害的報(bào)道。該病害一旦發(fā)生沒有有效措施控制，嚴(yán)重威脅著番茄的產(chǎn)量、品質(zhì)以及采后果實(shí)的抗性，造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。
[0003]我國(guó)有關(guān)番茄潰瘍病的記載始于1954年，目前該病在我國(guó)北京、黑龍江、吉林、遼寧、內(nèi)蒙古、新疆、河北、山西、山東、上海、安徽、海南、廣西等省、市、自治區(qū)都有發(fā)生，使許多地區(qū)番茄生產(chǎn)受到了不同程度的影響，近年來該病每年均有發(fā)生，且呈逐年擴(kuò)散和加重的趨勢(shì)。其中尤以甘肅、新疆、內(nèi)蒙古、河北等省區(qū)為甚。2011年河北省望都縣植保站對(duì)全縣番茄大棚進(jìn)行了系統(tǒng)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)番茄潰瘍病病棚率達(dá)75%以上。
[0004]引起該病的病原菌為密執(zhí)安棒狀桿菌密執(zhí)安亞種(Clavibacter michiganensissubsp.michiganensis, Cmm),被列入我國(guó)檢疫對(duì)象的名單。使用無菌種子和無菌苗是控制番茄細(xì)菌性潰瘍病的首要措施，因此對(duì)番茄細(xì)菌性潰瘍病的早期檢測(cè)是控制該病傳播和發(fā)生的有效手段。
[0005]環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediatedisothermal amplificat1n, LAMP)技術(shù)是Notomi等于2000年開發(fā)的一種新的恒溫體外核酸擴(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)利用能夠識(shí)別靶DNA上6個(gè)特定區(qū)域的4條引物和有鏈置換活性的Bst (Bacillus stearo thermophilus)DNA聚合酶，使模板兩端引物結(jié)合處循環(huán)出現(xiàn)環(huán)狀單鏈結(jié)構(gòu)，在等溫條件下使引物順利與模板結(jié)合并進(jìn)行鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)。由于LAMP獨(dú)特的核酸擴(kuò)增機(jī)制，它的產(chǎn)物是由多重復(fù)靶序列的莖-環(huán)狀DNA和花椰菜狀DNA所組成的混合物，在瓊脂糖凝膠電泳上會(huì)呈現(xiàn)出LAMP所特有的階梯狀條帶。擴(kuò)增產(chǎn)物不僅可以通過電泳檢測(cè)，還可以添加SYBR Green 1、溴化乙錠(EB)或其他核酸染色劑進(jìn)行顯色后觀察。該技術(shù)具有高特異性、快速靈敏、高效、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，建立穩(wěn)定、靈敏度高的LAMP反應(yīng)體系，可以為番茄潰瘍病菌的快速檢測(cè)提供便捷服務(wù)。
[0006]本發(fā)明根據(jù)具有亞種特異性的番茄潰瘍病菌ITS序列，設(shè)計(jì)了一組用于特異性檢測(cè)番茄潰瘍病菌的LAMP引物，并對(duì)反應(yīng)溫度和反應(yīng)體系中甜菜堿、MgS04、Bst DNA聚合酶、dNTPs等試劑的使用濃度進(jìn)行了優(yōu)化，最終建立了番茄潰瘍病病菌的LAMP檢測(cè)方法，此體系在具備水浴鍋和熒光染料的條件下，I h左右的反應(yīng)時(shí)間里就能夠有效地檢測(cè)到目的菌，而PCR擴(kuò)增結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)通常需要花費(fèi)3-4 h甚至更長(zhǎng)時(shí)間，因此在專業(yè)技術(shù)和實(shí)驗(yàn)設(shè)備不足的縣市級(jí)植保植檢部門，本發(fā)明建立的檢測(cè)方法更具備實(shí)用性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一組可用于檢測(cè)番茄潰瘍病菌的引物。
[0008]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種可用于快速檢測(cè)番茄潰瘍病菌的方法。
[0009]本發(fā)明所提供的用于檢測(cè)番茄潰瘍病菌的引物，是由序列表中的序列1、序列2、序列3和序列4的核苷酸序列組成的引物對(duì)。
[0010]將由序列表中序列1、序列2、序列3和序列4的核苷酸序列組成的引物組命名為cmm-LAMP，序列表中SEQ ID No:1由42個(gè)堿基組成，SEQ ID No: 2由41個(gè)堿基組成，SEQID No: 3由19個(gè)堿基組成，SEQ ID No: 4由18個(gè)堿基組成。
[0011]本發(fā)明所提供的快速檢測(cè)番茄潰瘍病菌的方法，是以待測(cè)番茄潰瘍病菌標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA為模板，在由序列表中序列1、序列2、序列3和序列4的核苷酸序列組成的引物組cmm-LAMP的引導(dǎo)下進(jìn)行等溫PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)可在100bp-1000bp之間產(chǎn)生梯度條帶，用SYBR Green I染色后可在擴(kuò)增管中呈現(xiàn)橘黃色。
[0012]其中，等溫?cái)U(kuò)增體系為:25 μ L總體系中含模板DNA 2 μ L，Betaine甜菜堿0.4mo I/L，MgSO4 2.0 mmol/L, Bst DNA 聚合酶 4U，dNTPs 1.0 mmol/L，引物 1、引物 2 各 1.5P L，引物 3、引物 4 各 0.5 μ L, I X Isothermal Amplificat1n Buffer,其余用無菌蒸懼水補(bǔ)充反應(yīng)體系至25.0 μ?。反應(yīng)程序?yàn)?65°C溫育40 min，80°C滅活10 min。
[0013]檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的方法有兩種:
其一為對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，然后用Goldview顯色。具體方法為:取5KL擴(kuò)增產(chǎn)物，加入0.5 μ L變性載樣指示劑(98%無離子甲酰胺，10 mM EDTA pH8.0,0.25%溴酚藍(lán))，在濃度為1.5%的瓊脂糖凝膠中電泳分離，檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物中是否在100 bp-1000bp之間產(chǎn)生梯度條帶。
[0014]其二為在擴(kuò)增產(chǎn)物中，按1/100的比例加入用10 X TBE稀釋的SYBR Green I染料，呈現(xiàn)橘黃色為陽性，說明模板中含有番茄潰瘍病菌基因組DNA，無顏色反應(yīng)色為陰性，說明模板中不含有番茄潰瘍病菌基因組DNA。
[0015]本發(fā)明提供了一組快速擴(kuò)增番茄潰瘍病菌基因組特定區(qū)段的引物cmm-LAMP，該引物將在田間及檢疫部門對(duì)番茄潰瘍病菌快速檢測(cè)及鑒定中發(fā)揮重要作用。
[0016]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0017]下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，引物由上海生工生物工程公司合成。番茄潰瘍病菌標(biāo)準(zhǔn)菌株由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)李建強(qiáng)教授提供，并由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生物防治研究室收集保存。
[0018]實(shí)施例1、番茄潰瘍病菌模板DNA的獲得
用改良523培養(yǎng)基培養(yǎng)番茄潰瘍病菌，25°C振蕩培養(yǎng)3天，收集菌體后加無菌水100PL,95°C加熱 10 min, 1000 r/min 離心 5 min 制成模板。
[0019]實(shí)施例2、番茄潰瘍病菌LAMP擴(kuò)增及檢測(cè)
反應(yīng)體系為:25 μ L總體系中含模板DNA 2 μ L，Betaine甜菜堿0.4 mo I/L7MgSO4 2.0mmol/L, Bst DNA 聚合酶 4U，dNTPs 1.0 mmol/L，引物 1、引物 2 各 1.5 μ L，引物 3、引物 4各 0.5 μ L,I X Isothermal Amplificat1n Buffer。
[0020]反應(yīng)程序程序?yàn)?65°C溫育40 min，80°C滅活20 min。
[0021]檢測(cè)方法為:取5 μ L LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果(見圖1)。
[0022]SYBR Green I染料用10XTBE稀釋，按1/100的比例加入剩余的擴(kuò)增產(chǎn)物中，觀察顏色變化(見圖2)。
【附圖說明】
[0023]圖1為番茄潰瘍病菌LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。
圖2為番茄潰瘍病菌LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)SYBR Green I染色結(jié)果。
圖1中M為分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000，I泳道為陰性對(duì)照，2-3泳道為番茄潰瘍病菌。圖2中(+)為番茄潰瘍病菌，(_)為陰性對(duì)照。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一組番茄潰瘍病菌快速檢測(cè)的專用引物，其特征在于，是由序列表中的序列1、序列2、序列3和序列4的核苷酸序列組成的引物組。
2.—種番茄潰瘍病菌快速檢測(cè)的的方法，其特征在于，是以番茄潰瘍病菌標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA為模板，在由權(quán)利要求1所述的序列表中序列1、序列2、序列3和序列4的核苷酸序列組成的引物組的引導(dǎo)下進(jìn)行恒溫PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)在100bp-1000bp之間有梯度條帶。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，25μ L總體系中含模板DNA 2 μ L，Betaine 甜菜喊0.4 mol/L, MgSO4 2.0 mmol/L, Bst DNA聚合酶 4U, dNTPs 1.0 mmol/L,引物1、弓丨物 2 各 1.5 μ L，引物 3、引物 4 各 0.5 μ L, I X Isothermal Amplificat1n Buffer,其余用無菌蒸餾水補(bǔ)充反應(yīng)體系至25.0 μ?，反應(yīng)程序?yàn)?65°C溫育40 min，80°C滅活10 min。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于，檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的方法可為對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5 %瓊脂糖凝膠電泳,然后用Goldview顯色。
5.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于，檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的方法可為在擴(kuò)增產(chǎn)物中按1/100的比例加入用10XTBE稀釋的SYBR Green I染料。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種番茄潰瘍病菌快速檢測(cè)的方法及其專用引物，專用引物是由序列表中的序列1、序列2、序列3和序列4的核苷酸序列組成的引物組。檢測(cè)番茄潰瘍病菌的方法，是以番茄潰瘍病菌標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA為模板，在由權(quán)利要求1所述的序列表中序列1、序列2、序列3和序列4的核苷酸序列組成的引物組的引導(dǎo)下進(jìn)行恒溫PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)在100 bp-1000bp之間有梯度條帶，擴(kuò)增產(chǎn)物用SYBR Green I直接染色可呈現(xiàn)橘黃色。本發(fā)明提供了的一組快速擴(kuò)增番茄潰瘍病菌基因組特定區(qū)段的引物，該引物將在田間及檢疫部門對(duì)番茄潰瘍病菌快速檢測(cè)及鑒定中發(fā)揮重要作用。
【IPC分類】C12Q1-68, C12Q1-04, C12R1-01, C12N15-11
【公開號(hào)】CN104651490
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410823689
【發(fā)明人】張娜, 楊文香, 趙賽, 劉大群
【申請(qǐng)人】河北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年5月27日
【申請(qǐng)日】2014年12月26日