一種間充質(zhì)干細(xì)胞的預(yù)處理方法及其所得制劑的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種在低氧環(huán)境下對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行預(yù)處理的方法，屬于生物科技領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)是來(lái)源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層的干細(xì)胞，具有多向分化潛能、造血支持和促進(jìn)干細(xì)胞植入、免疫調(diào)控和自我復(fù)制等特點(diǎn)，由于間充質(zhì)干細(xì)胞具有支持造血和調(diào)節(jié)免疫等作用，在造血重建、組織修復(fù)、免疫治療等方面具有傳統(tǒng)化學(xué)藥物所無(wú)法實(shí)現(xiàn)的效果，因此在醫(yī)學(xué)研宄和臨床研宄中受到了廣泛關(guān)注。
[0003]目前，對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方式是從來(lái)源組織中被分離出來(lái)之后，將其在大氣環(huán)境中進(jìn)行普通培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)4?6代的傳代，使其擴(kuò)增到一定數(shù)量，即可用于疾病干預(yù)。研宄發(fā)現(xiàn)，人類健康體內(nèi)氧氣濃度一般處于1%?12%，當(dāng)通常大氣環(huán)境中培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行移植治療時(shí)，移植的間充質(zhì)干細(xì)胞面臨氧氣濃度從21%到低氧的變化，在不同的氧濃度環(huán)境下間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性是不同的，這種快速的氧濃度變化導(dǎo)致大量間充質(zhì)干細(xì)胞的死亡，使得間充質(zhì)干細(xì)胞在人體內(nèi)的低氧環(huán)境條件下無(wú)法發(fā)揮干預(yù)疾病治療的效果。
[0004]針對(duì)上述問(wèn)題，本領(lǐng)域近年來(lái)也提出過(guò)若干解決方案。申重陽(yáng)等人曾提出了一種在移植前對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行程序性氧濃度預(yù)處理的方法，該方法為了提高間充質(zhì)干細(xì)胞在低氧環(huán)境下的存活率對(duì)其培養(yǎng)環(huán)境進(jìn)行了程序性處理，具體做法是將氧氣濃度進(jìn)行下述程序性調(diào)節(jié):Oh:21% -15% ；2h:15% -10% ；4h:10% -5% ；6h:5% -2% ;8h_20h:2%培養(yǎng)至移植，該技術(shù)方案有效提高了間充質(zhì)干細(xì)胞在低氧環(huán)境的存活率。但長(zhǎng)期研宄也發(fā)現(xiàn)，該技術(shù)方案存在若干缺陷，突出表現(xiàn)在對(duì)氧氣濃度的調(diào)整過(guò)于激進(jìn)，使得間充質(zhì)干細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中的存活率過(guò)低；更重要的是，該預(yù)處理方法調(diào)整了間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性，使其在正常疾病下的人體環(huán)境中無(wú)法發(fā)揮出正常間充質(zhì)干細(xì)胞的疾病干預(yù)治療特性。上述缺陷的存在，導(dǎo)致該方案多年來(lái)始終處于科研階段，無(wú)法滿足臨床干預(yù)治療需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]在多年和科研和臨床研宄中，申請(qǐng)人對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性進(jìn)行了深入研宄，并創(chuàng)造性的發(fā)明了一種對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理的方法，大大提高了培養(yǎng)所得間充質(zhì)干細(xì)胞在人體內(nèi)低氧環(huán)境下的存活能力，更關(guān)鍵的該方法過(guò)程收率高，且所得間充質(zhì)干細(xì)胞依舊保持了良好的干預(yù)治療特性，具有優(yōu)越的科研和臨床應(yīng)用前景。
[0006]具體地說(shuō)，本發(fā)明是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0007]一種間充質(zhì)干細(xì)胞的預(yù)處理方法，在低氧環(huán)境下將間充質(zhì)干細(xì)胞在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其中所用的低氧環(huán)境氧氣濃度自21 %隨培養(yǎng)時(shí)間逐漸降低。
[0008]申請(qǐng)人廣泛研宄了低氧環(huán)境的終濃度和氧氣濃度降低速率對(duì)培養(yǎng)過(guò)程中的間充質(zhì)干細(xì)胞收率及其活性的影響，發(fā)現(xiàn)將氧氣濃度逐漸降低至氧氣終濃度為9%具有理想的效果，因此本發(fā)明優(yōu)選所述低氧環(huán)境的氧氣終濃度為9%。
[0009]更優(yōu)選的，在所述低氧環(huán)境中，氧氣濃度每隔4小時(shí)降低I %，至氧氣終濃度為
[0010]在本發(fā)明中，所用的培養(yǎng)基可選擇干細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域常見(jiàn)基礎(chǔ)培養(yǎng)基，包括但不限于M199，DMEM，IMDM, RPM1-1640, DF-12等。優(yōu)選的，為了改善增值速度，還可以向其中加入合適的添加物，所述添加物包括但不限于胎(小)牛血清，生長(zhǎng)因子，氨基酸，促粘附因子等，上述添加物的用量可根據(jù)實(shí)際需要進(jìn)行調(diào)整，通常的，是在500ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入5-50ml的添加物。
[0011]為了提高間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)低氧環(huán)境的適應(yīng)性，啟動(dòng)其細(xì)胞周期調(diào)控，在其轉(zhuǎn)移進(jìn)入低氧培養(yǎng)箱時(shí)將氧濃度降低1%，然后每隔4小時(shí)將低氧培養(yǎng)箱的氧濃度降低1%，也就是共計(jì)降低12次，從21%降至9%。
[0012]雖然間充質(zhì)干細(xì)胞直接在低氧環(huán)境下培養(yǎng)能提高其存活能力，但是這樣的培養(yǎng)方式導(dǎo)致間充質(zhì)干細(xì)胞擴(kuò)增速度慢、生產(chǎn)成本高。為了提高干細(xì)胞的生長(zhǎng)和擴(kuò)增速率，本發(fā)明的的預(yù)處理方法還包括在低氧環(huán)境培養(yǎng)前對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)的步驟，通過(guò)將間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行普通培養(yǎng)傳代，傳代至第3至第4代，有效擴(kuò)增間充質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)量。
[0013]為了提高間充質(zhì)干細(xì)胞的質(zhì)量，上述方法還包括對(duì)預(yù)培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行篩選的步驟，搜集傳代至間充質(zhì)干細(xì)胞第3至第4代的貼壁生長(zhǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞將轉(zhuǎn)移進(jìn)入低氧培養(yǎng)環(huán)境中。
[0014]相應(yīng)的，本發(fā)明還公開(kāi)了一種間充質(zhì)干細(xì)胞制劑，基于本發(fā)明所公開(kāi)的預(yù)處理方法培養(yǎng)得到。
[0015]由于本發(fā)明所公開(kāi)的間充質(zhì)干細(xì)胞制劑的生物學(xué)特性，本發(fā)明還公開(kāi)了所述間充質(zhì)干細(xì)胞制劑在干預(yù)高血糖疾病治療中的應(yīng)用。
[0016]眾所周知，2型糖尿病患者的發(fā)病與身體的免疫異常狀態(tài)有關(guān)，由于免疫系統(tǒng)攻擊自身組織細(xì)胞的胰島素受體，使其逐漸喪失對(duì)胰島素的敏感性，從而發(fā)生高糖血癥，進(jìn)而進(jìn)展至糖尿病。在易患2型糖尿病的肥胖人群身體中，脂肪組織占比較大，是主要消耗胰島素的組織，也是免疫異常最容易涉及的組織。在采用間充質(zhì)干細(xì)胞干預(yù)上述疾病治療時(shí)，使間充質(zhì)干細(xì)胞在進(jìn)入體內(nèi)之后盡快適應(yīng)脂肪組織的低氧狀態(tài)使是其發(fā)揮干預(yù)作用的基礎(chǔ)，本發(fā)明公開(kāi)的技術(shù)方案解決了該問(wèn)題。
【附圖說(shuō)明】
[0017]圖1為不同培養(yǎng)方法下間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)物的顯微鏡觀察圖。
【具體實(shí)施方式】
[0018]為了說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)現(xiàn)方案及其效果，在如下實(shí)施例中申請(qǐng)人提供了本發(fā)明的若干較優(yōu)實(shí)現(xiàn)，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)的方式說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案對(duì)提高間充質(zhì)干細(xì)胞存活能力、活性的效果。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解如下所提供的示例僅為示意性的，并不對(duì)本發(fā)明構(gòu)成特別限定。
[0019]實(shí)施例1:本發(fā)明公開(kāi)的預(yù)處理方法，優(yōu)選是通過(guò)如下過(guò)程進(jìn)行的:
[0020]用基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加物培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞。在本實(shí)施例中，選擇基礎(chǔ)培養(yǎng)基為500ml的DMEM，添加物包括25ml的胎(小)牛血清、5ml生長(zhǎng)因子、3ml氨基酸。這并非限制性的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)需要選擇其他合適的類型和成分。
[0021]傳代至第3至第4代時(shí)，搜集貼壁生長(zhǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)瓶中，將其轉(zhuǎn)置于低氧培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48小時(shí):間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)移進(jìn)入低氧培養(yǎng)箱時(shí)將氧濃度降低1%，之后每隔4小時(shí)將低氧培養(yǎng)箱的氧濃度降低1%，至氧氣終濃度降至9% (在上述過(guò)程中二氧化碳濃度保持為5% )。
[0022]對(duì)比實(shí)施例1
[0023]間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行普通培養(yǎng)傳代(采用與本發(fā)明方案同樣的培養(yǎng)基)，傳代至第3至第4代時(shí)，搜集貼壁生長(zhǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到新培養(yǎng)瓶中，在正?？諝猸h(huán)境中培養(yǎng)48小時(shí)。
[0024]對(duì)比實(shí)施例2
[0025]間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行普通培養(yǎng)傳代(采用與本發(fā)明方案同樣的培養(yǎng)基)，傳代至第3至第4代時(shí)，搜集貼壁生長(zhǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到新浮培養(yǎng)瓶中，在如下低氧環(huán)境中培養(yǎng)48小時(shí):放入到培養(yǎng)箱中，調(diào)節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)箱至02濃度為15% ;2h后調(diào)節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)箱至02濃度為10% ；4h后調(diào)節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)箱至02濃度為5% ；6h后調(diào)節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)箱至02濃度為2% ；一直將細(xì)胞培養(yǎng)箱維持在02濃度為2%，至培養(yǎng)結(jié)束。
[0026]申請(qǐng)人首先采用Invitrogen公司的全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀Countess對(duì)培養(yǎng)所得間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行了細(xì)胞計(jì)數(shù)。上述三個(gè)實(shí)施例均采用原始活率為98.5%的間充質(zhì)干細(xì)胞，對(duì)終產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果顯示，實(shí)施例1的間充質(zhì)干細(xì)胞活率為98.3%、對(duì)比實(shí)施例1的間充質(zhì)干細(xì)胞活率為65.8%，對(duì)比實(shí)施例2的間充質(zhì)干細(xì)胞活率為88.3%，該試驗(yàn)結(jié)果顯示盡管對(duì)比實(shí)施例2采用的程序性低氧培養(yǎng)過(guò)程也實(shí)現(xiàn)了間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)低氧環(huán)境的適應(yīng)，但是該方式氧氣變化沒(méi)有考慮到間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)低氧環(huán)境的適應(yīng)能力，使得干細(xì)胞活率降低較大。
[0027]為了研宄上述不同的培養(yǎng)方式對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞免疫能力的影響，申請(qǐng)人使用免疫染色的方法，采用顯微鏡觀察了如上三個(gè)實(shí)施例的鏡下細(xì)胞聚集狀態(tài)。其中，實(shí)施例1的干細(xì)胞中心形成了細(xì)胞集落，干細(xì)胞的增殖在集落的邊緣向外蔓延。而對(duì)比實(shí)施例1、2的干細(xì)胞很少形成細(xì)胞集落或無(wú)序分散。如圖1所示，其中A、B、C依次為實(shí)施例1、對(duì)比2、對(duì)比I的顯微鏡下圖。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種間充質(zhì)干細(xì)胞的預(yù)處理方法，其特征在于在低氧環(huán)境下將間充質(zhì)干細(xì)胞在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其中所用的低氧環(huán)境氧氣濃度自21 %隨培養(yǎng)時(shí)間逐漸降低。2.根據(jù)權(quán)利要求1的預(yù)處理方法，其特征在于所述低氧環(huán)境的氧氣終濃度為9%。3.根據(jù)權(quán)利要求2的預(yù)處理方法，其特征在于在所述低氧環(huán)境中，氧氣濃度每隔4小時(shí)降低1%，至氧氣終濃度為9%。4.根據(jù)權(quán)利要求1的預(yù)處理方法，其特征在于還包括在低氧環(huán)境培養(yǎng)前對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)的步驟，將間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行普通培養(yǎng)傳代，傳代至第3至第4代。5.根據(jù)權(quán)利要求4的預(yù)處理方法，其特征在于還包括對(duì)預(yù)培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行篩選的步驟，搜集傳代至間充質(zhì)干細(xì)胞第3至第4代的貼壁生長(zhǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞。6.一種間充質(zhì)干細(xì)胞制劑，基于權(quán)利要求1的預(yù)處理方法培養(yǎng)得到。7.權(quán)利要求6的間充質(zhì)干細(xì)胞制劑在干預(yù)高血糖疾病治療中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種間充質(zhì)干細(xì)胞的預(yù)處理方法及其所得制劑，包括在低氧環(huán)境下將間充質(zhì)干細(xì)胞在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其中所用的低氧環(huán)境氧氣濃度自21％隨培養(yǎng)時(shí)間逐漸降低。本發(fā)明所公開(kāi)的預(yù)處理方法所培養(yǎng)的干細(xì)胞制劑能有效適應(yīng)人體脂肪組織的低氧狀態(tài)，提高對(duì)糖尿病的預(yù)防和治療效果。
【IPC分類】A61P3/10, A61K35/28, C12N5/0775
【公開(kāi)號(hào)】CN104946586
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510430189
【發(fā)明人】龔偉
【申請(qǐng)人】龔偉
【公開(kāi)日】2015年9月30日
【申請(qǐng)日】2015年7月20日