用白色小槍頭或牙簽將沉淀挑出來到新的干凈的I. 5ml離心管中，用 75% vol乙醇洗滌沉淀二遍，再用600 μ I DEPC水充分溶解沉淀。
[0042] (6)加入600 μ I Tris平衡酚充分混勻抽提，靜置5min，4°C冷凍離心機中以轉速 為 12000rpm 離心 lOmin。
[0043] (7)取上清液并在上清液中加入與上清液等體積的事先預冷的無水乙醇于_40°C 冰箱中沉淀30min，再次用白色小槍頭或牙簽將白色沉淀挑出來到新的干凈的I. 5ml離心 管中，用75% vol乙醇洗滌沉淀二遍，短時間（5min左右）晾干后，用200 μ I DEPC水或TE 溶解沉淀。
[0044] 2、PCR 擴增
[0045] 以步驟1中得到的馬鈴薯樣本的基因組DNA為模板，分別采用序列表的專用引物 序列進行PCR擴增；
[0046] 所述專用引物的序列為：
[0047] Pl :GAATTCCGGCGGCGATC ;如 SEQ ID No: 1 所示。
[0048] P2 :GAATTCCGGCGGCGAAC ;如 SEQ ID No:2 所示。
[0049] P3 :GAATTCCGGCGGCGTAC ;如 SEQ ID No:3 所示。
[0050] P4 :GAATTCCGGCGGCGTCG ;如 SEQ ID No:4 所示。
[0051] P5 :GAATTCCGGCGGCGTGA ;如 SEQ ID No:5 所示。
[0052] P6 :GAATTCCGCCGCCGATA ;如 SEQ ID No:6 所示。
[0053] P7 :ATATATCGGCGGCGATC ;如 SEQ ID No:7 所示。
[0054] PCR擴增的程序是：94°C預變性4min ;94°C變性30s，50°C退火lmin，72°C延伸 I. 5min，其中，變性、退火和延伸三個步驟循環(huán)35次；72°C最后一步延伸lOmin，10°C保存。
[0055] PCR 擴增體系為 20ul，包括：10XPCR 含 Mg2+的 Buffer 2. Oul，各 2. 5mM 的 dNTPO. 5ul，lOpmol/ul 每條專用引物 lul，2. 5U/ul 的 Taq 酶 0· 4ul，50ng/ul 的 DNA 模板 1.0 ul，ddH20 補足。
[0056] 3、電泳
[0057] 對步驟2中得到的PCR擴增產物進行1. 5 %瓊脂糖凝膠電泳分離。PCR擴增結束 后，PCR擴增產物中加入4ul電泳上樣緩沖液（6xLoading buffer)混勾，取6ul混合樣品 在I. 5%瓊脂糖凝膠中電泳，電泳緩沖液為ΙχΤΑΕ，電泳條件為120V的電壓下電泳lh。
[0058] 4、染色顯影
[0059] 將10mg/ml的EB液20ul溶于500ml雙蒸水中，溶液的顏色達到微微黃色即可。將 電泳后的瓊脂糖凝膠放入EB染色液（溴化乙錠）中，染色20min，然后將膠取出，用自來水 輕輕沖洗膠塊3遍，即可放入凝膠成像系統(tǒng)的UV下進行顯色觀察并拍照。
[0060] 5、條帶統(tǒng)計及結果分析
[0061] 對成像的瓊脂糖凝膠電泳圖譜上的條帶進行人工記錄和統(tǒng)計，將每一條帶視為一 個位點，有條帶的記為1，無條帶的記為〇,從而形成0-1數據矩陣。結果表明獲得了擴增效 果好、多態(tài)性高和指紋豐富的馬鈴薯DNA指紋圖譜，這些引物可以把9份馬鈴薯品種全部區(qū) 分開來，條帶大小分部在250bp-2000bp之間，擴增總條帶數81條，多態(tài)性條帶數69條，多 態(tài)性85. 19%，平均擴增條帶數11. 57條，部分結果如圖1~圖7和表1所示。
[0062] 表1 7條單引物在9份馬鈴薯上獲得的條帶數統(tǒng)計表
[0063]
[0064] 實施例2馬鈴薯DNA指紋圖譜的應用
[0065] 對實施例1獲得的馬鈴薯DNA指紋圖譜進行聚類分析，得到聚類樹狀圖，如圖8所 示，可以看出，在遺傳距離的閾值約為0. 55時，可將9份馬鈴薯品種分成2大組。第一大組 包括冀張薯8號、中薯13號、中薯14號、費烏瑞它、中薯6號、中薯8號和中薯17號共7個 馬鈴薯品種；第二大組只包括中薯11號和中薯7號2個品種。在遺傳距離的閾值約為0. 36 時，可將第一大組分成兩個小組。在遺傳距離的閾值約為〇. 30時，又可進一步劃分。
[0066] 以上內容是結合具體的優(yōu)選實施方式對本發(fā)明所作的進一步詳細說明，不能認定 本發(fā)明的具體實施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬技術領域的普通技術人員來說，在 不脫離本發(fā)明構思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應當視為屬于本發(fā)明的 保護范圍。
【主權項】
1. 一種獲取馬鈴薯DNA指紋圖譜的專用引物，由序列表的序列SEQIDNO: 1~7組成。2. -種獲取馬鈴薯DNA指紋圖譜的方法，其特征在于，包括如下步驟： 步驟A:提取馬鈴薯的基因組DNA; 步驟B:以步驟A的馬鈴薯的基因組DNA為模板，采用權利要求1所述的專用引物進行PCR擴增； 步驟C:對步驟B中得到的PCR擴增產物進行1. 5%瓊脂糖凝膠電泳分離，用EB染色顯 示馬鈴薯的DNA指紋圖譜。3. 根據權利要求2所述的獲取馬鈴薯DNA指紋圖譜的方法，其特征在于：步驟B中，所 述PCR擴增的程序是：94°C預變性4min，94°C變性30s，50°C退火lmin，72°C延伸I. 5min，其 中，變性、退火和延伸三個步驟循環(huán)35次，72°C最后一步延伸lOmin，KTC保存。4. 根據權利要求3所述的獲取馬鈴薯DNA指紋圖譜的方法，其特征在于：所述PCR擴 增的體系為 20ul，包括：10XPCR含Mg2+的Buffer2.Oul，2. 5mM的dNTP0? 5ul，lOpmol/ul 每條專用引物lul，2.5U/ul的Taq酶 0.4ul，50ng/ul的DNA模板 1.0ul，ddH20 補足。5. 根據權利要求2~4任意一項所述的獲取馬鈴薯DNA指紋圖譜的方法，其特征在于： 所述馬鈴薯的基因組DNA來自馬鈴薯植株的幼嫩葉片。6. 權利要求1所述的專用引物在獲取馬鈴薯DNA指紋圖譜中的應用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了馬鈴薯的一種DNA指紋圖譜及其獲取方法與其專用引物。所述獲取馬鈴薯DNA指紋圖譜的專用引物，由序列表的序列SEQ ID NO:1~7組成。本發(fā)明提供的方法包括如下步驟：提取馬鈴薯的基因組DNA；以基因組DNA為模板，利用所述專用引物進行PCR擴增；將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳分離，用EB染色顯示馬鈴薯的DNA指紋圖譜。本發(fā)明獲得的馬鈴薯DNA指紋圖譜多態(tài)性高、指紋豐富，為提高馬鈴薯選擇育種的準確性和效率，縮短育種周期，及馬鈴薯的分子標記輔助育種奠定了技術基礎。
【IPC分類】C12N15/11, C12Q1/68
【公開號】CN104928395
【申請?zhí)枴緾N201510389895
【發(fā)明人】熊發(fā)前, 劉俊仙, 蔣菁, 唐秀梅, 賀梁瓊, 黃志鵬, 李忠, 韓柱強, 鐘瑞春, 唐榮華, 何海旺, 唐洲萍
【申請人】廣西壯族自治區(qū)農業(yè)科學院經濟作物研究所
【公開日】2015年9月23日
【申請日】2015年7月6日