的重量比為1:8 ；
B、解凍上述水蛭素粗品，取290ml加進4倍置冰箱中4°C下預冷的含15%水的冷丙酮中，攪拌后置冰箱中4°C下讓其沉淀過夜，次日吸出上清丙酮并離心，在所得沉淀中加入預冷的三氯乙酸28ml使其溶解，離心除去殘渣，得唾液腺分泌物濃縮液；
C、用陰離子交換柱層析法對上述唾液腺分泌物濃縮液進行洗脫后，進行凝膠過濾柱層析，即得。
[0026]所述的水蛭充分饑餓的時間為18天，水蛭吸飽誘導物質(zhì)的時間為50分鐘。
[0027]所述的硫酸鋅質(zhì)量分數(shù)為0.8%，所述的乙醇質(zhì)量分數(shù)為9%。
[0028]所述的步驟C中陰離子交換柱層析法的具體操作如下:
取適量二乙基氨基纖維素陰離子交換劑加蒸餾水使其膨脹，依次用0.5mol/L的NaOH-NaCl混合液、0.5mol/L的HCl及0.5mol/L的NaOH-NaCl混合液各浸泡300分鐘后用蒸飽水洗滌至中性；裝柱2cm X 60cm至所需高度，用pH=4.6的0.lmol/L梓檬酸鈉緩沖液平衡；用5ml的唾液腺分泌物濃縮液或上述三氯乙酸溶液上樣進行梯度洗脫并用核酸蛋白檢測儀記錄繪制出洗脫曲線，分段收集洗脫液，流速為30ml/小時；經(jīng)檢測將有活力部分集中于透析袋中用甘油濃縮，即得。
[0029]所述的步驟C中凝膠過濾柱層析的具體操作如下:
取適量的交聯(lián)葡聚糖離子交換劑加蒸餾水浸泡4小時，用0.5mol/L NaOH-0.5mol/LNaCl混合液浸泡半小時，抽濾除去鹼液并用蒸餾水洗滌至中性，加熱煮沸除去氣泡；裝柱1.5cm X 50cm至所需高度，用pH=7.4的0.lmol/L Tris-HCl-NaCl緩沖液平衡，將上述有活力洗脫液的透析袋甘油濃縮液上樣洗脫，分段收集洗脫液，流速為90ml/小時。
[0030]實施例4
本發(fā)明的從水蛭唾液中提取水蛭素的方法，包括以下步驟:
A、將水蛭置于容器中充分饑餓，投入誘導物質(zhì)至水蛭吸飽后，加入催吐劑使其吐出體內(nèi)的唾液即天然水蛭素粗品液體，然后取出吸血水蛭活體并將其沖洗干凈后返回飼養(yǎng)池繼續(xù)飼養(yǎng)；同時收集容器內(nèi)的水蛭素粗品液體，置冰箱中冷凍保存待用；
所述的誘導物質(zhì)由蚯蚓提取液300ml、殼聚糖50g、黃芪多糖20g、葡萄糖粉30g組成；所述的催吐劑為硫酸鋅與乙醇的混合液，其比例為1: 2，催吐劑的用量與水蛭活體之間的重量比為1: 10;
B、解凍上述水蛭素粗品，取OOml加進4倍置冰箱中4°C下預冷的含15%水的冷丙酮中，攪拌后置冰箱中4°C下讓其沉淀過夜，次日吸出上清丙酮并離心，在所得沉淀中加入預冷的三氯乙酸30ml使其溶解，離心除去殘渣，得唾液腺分泌物濃縮液；
C、用陰離子交換柱層析法對上述唾液腺分泌物濃縮液進行洗脫后，進行凝膠過濾柱層析，即得。
[0031 ] 所述的水蛭充分饑餓的時間為20天，水蛭吸飽誘導物質(zhì)的時間為60分鐘。
[0032]所述的硫酸鋅質(zhì)量分數(shù)為1%，所述的乙醇質(zhì)量分數(shù)為10%。
[0033]所述的步驟C中陰離子交換柱層析法的具體操作如下:
取適量二乙基氨基纖維素陰離子交換劑加蒸餾水使其膨脹，依次用0.5mol/L的NaOH-NaCl混合液、0.5mol/L的HCl及0.5mol/L的NaOH-NaCl混合液各浸泡300分鐘后用蒸飽水洗滌至中性；裝柱2cm X 60cm至所需高度，用pH=4.6的0.lmol/L梓檬酸鈉緩沖液平衡；用5ml的唾液腺分泌物濃縮液或上述三氯乙酸溶液上樣進行梯度洗脫并用核酸蛋白檢測儀記錄繪制出洗脫曲線，分段收集洗脫液，流速為30ml/小時；經(jīng)檢測將有活力部分集中于透析袋中用甘油濃縮，即得。
[0034]所述的步驟C中凝膠過濾柱層析的具體操作如下:
取適量的交聯(lián)葡聚糖離子交換劑加蒸餾水浸泡4小時，用0.5mol/L NaOH-0.5mol/LNaCl混合液浸泡半小時，抽濾除去鹼液并用蒸餾水洗滌至中性，加熱煮沸除去氣泡；裝柱1.5cm X 50cm至所需高度，用pH=7.4的0.lmol/L Tris-HCl-NaCl緩沖液平衡，將上述有活力洗脫液的透析袋甘油濃縮液上樣洗脫，分段收集洗脫液，流速為90ml/小時。
[0035]實施例5
從水蛭唾液中提取水蛭素的方法，包括以下步驟:
A、將水蛭置于容器中充分饑餓，投入誘導物質(zhì)至水蛭吸飽后，加入催吐劑使其吐出體內(nèi)的唾液即天然水蛭素粗品液體，然后取出吸血水蛭活體并將其沖洗干凈后返回飼養(yǎng)池繼續(xù)飼養(yǎng)；同時收集容器內(nèi)的水蛭素粗品液體，置冰箱中冷凍保存待用；
所述的誘導物質(zhì)由蚯蚓提取液200ml、殼聚糖10g、黃芪多糖15g、葡萄糖粉15g組成；所述的催吐劑為硫酸鋅與乙醇的混合液，其比例為1: 2，催吐劑的用量與水蛭活體之間的重量比為1:2;
B、解凍上述水蛭素粗品，取250~300ml加進4倍置冰箱中4°C下預冷的含15%水的冷丙酮中，攪拌后置冰箱中4°C下讓其沉淀過夜，次日吸出上清丙酮并離心，在所得沉淀中加入預冷的三氯乙酸25ml使其溶解，離心除去殘渣，得唾液腺分泌物濃縮液；
C、用陰離子交換柱層析法對上述唾液腺分泌物濃縮液進行洗脫后，進行凝膠過濾柱層析，即得。
[0036]所述的水蛭充分饑餓的時間為15天，水蛭吸飽誘導物質(zhì)的時間為50分鐘。
[0037]所述的硫酸鋅質(zhì)量分數(shù)為0.25%，所述的乙醇質(zhì)量分數(shù)為6%。
[0038]所述的步驟C中陰離子交換柱層析法的具體操作如下:
取適量二乙基氨基纖維素陰離子交換劑加蒸餾水使其膨脹，依次用0.5mol/L的NaOH-NaCl混合液、0.5mol/L的HCl及0.5mol/L的NaOH-NaCl混合液各浸泡300分鐘后用蒸飽水洗滌至中性；裝柱2cm X 60cm至所需高度，用pH=4.6的0.lmol/L梓檬酸鈉緩沖液平衡；用5ml的唾液腺分泌物濃縮液或上述三氯乙酸溶液上樣進行梯度洗脫并用核酸蛋白檢測儀記錄繪制出洗脫曲線，分段收集洗脫液，流速為30ml/小時；經(jīng)檢測將有活力部分集中于透析袋中用甘油濃縮，即得。
[0039]所述的步驟C中凝膠過濾柱層析的具體操作如下:
取適量的交聯(lián)葡聚糖離子交換劑加蒸餾水浸泡4小時，用0.5mol/L NaOH-0.5mol/LNaCl混合液浸泡半小時，抽濾除去鹼液并用蒸餾水洗滌至中性，加熱煮沸除去氣泡；裝柱1.5cm X 50cm至所需高度，用pH=7.4的0.lmol/L Tris-HCl-NaCl緩沖液平衡，將上述有活力洗脫液的透析袋甘油濃縮液上樣洗脫，分段收集洗脫液，流速為90ml/小時。
【主權(quán)項】
1.一種從水蛭唾液中提取水蛭素的方法，其特征在于，包括以下步驟: A、將水蛭置于容器中充分饑餓，投入誘導物質(zhì)至水蛭吸飽后，加入催吐劑使其吐出體內(nèi)的唾液即天然水蛭素粗品液體，然后取出吸血水蛭活體并將其沖洗干凈后返回飼養(yǎng)池繼續(xù)飼養(yǎng)；同時收集容器內(nèi)的水蛭素粗品液體，置冰箱中冷凍保存待用； 所述的誘導物質(zhì)由蚯蚓提取液10?300ml、殼聚糖5?50g、黃芪多糖I?20g、葡萄糖粉1?30g組成； 所述的催吐劑為硫酸鋅與乙醇的混合液，其比例為1:1?2，催吐劑的用量與水蛭活體之間的重量比為1:1?10 ; B、解凍上述水蛭素粗品，取250~300ml加進4倍置冰箱中4°C下預冷的含15%水的冷丙酮中，攪拌后置冰箱中4°C下讓其沉淀過夜，次日吸出上清丙酮并離心，在所得沉淀中加入預冷的三氯乙酸20-30ml使其溶解，離心除去殘渣，得唾液腺分泌物濃縮液； C、用陰離子交換柱層析法對上述唾液腺分泌物濃縮液進行洗脫后，進行凝膠過濾柱層析，即得。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從水蛭唾液中提取水蛭素的方法，其特征在于:所述的水蛭充分饑餓的時間為15?20天，水蛭吸飽誘導物質(zhì)的時間為20?50分鐘。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從水蛭唾液中提取水蛭素的方法，其特征在于:所述的硫酸鋅質(zhì)量分數(shù)為0.05~1%，所述的乙醇質(zhì)量分數(shù)為5~10%。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從水蛭唾液中提取水蛭素的方法，其特征在于，所述的步驟C中陰離子交換柱層析法的具體操作如下: 取適量二乙基氨基纖維素陰離子交換劑加蒸餾水使其膨脹，依次用0.5mol/L的NaOH-NaCl混合液、0.5mol/L的HCl及0.5mol/L的NaOH-NaCl混合液各浸泡300分鐘后用蒸飽水洗滌至中性；裝柱2cm X 60cm至所需高度，用pH=4.6的0.lmol/L梓檬酸鈉緩沖液平衡；用5ml的唾液腺分泌物濃縮液或上述三氯乙酸溶液上樣進行梯度洗脫并用核酸蛋白檢測儀記錄繪制出洗脫曲線，分段收集洗脫液，流速為30ml/小時；經(jīng)檢測將有活力部分集中于透析袋中用甘油濃縮，即得。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從水蛭唾液中提取水蛭素的方法，其特征在于，所述的步驟C中凝膠過濾柱層析的具體操作如下: 取適量的交聯(lián)葡聚糖離子交換劑加蒸餾水浸泡4小時，用0.5mol/L NaOH-0.5mol/LNaCl混合液浸泡半小時，抽濾除去鹼液并用蒸餾水洗滌至中性，加熱煮沸除去氣泡；裝柱.1.5cm X 50cm至所需高度，用pH=7.4的0.lmol/L Tris-HCl-NaCl緩沖液平衡，將上述有活力洗脫液的透析袋甘油濃縮液上樣洗脫，分段收集洗脫液，流速為90ml/小時。
【專利摘要】本發(fā)明公開一種從水蛭唾液中提取水蛭素的方法，包括以下步驟：A、將水蛭置于容器中充分饑餓，投入誘導物質(zhì)至水蛭吸飽后，加入催吐劑使其吐出體內(nèi)的唾液，然后取出吸血水蛭活體返回飼養(yǎng)池繼續(xù)飼養(yǎng)，同時收集容器內(nèi)的水蛭素粗品液體；B、解凍上述水蛭素粗品，加進預冷的冷丙酮中，攪拌后置冰箱中沉淀過夜，次日吸出上清丙酮并離心，加入三氯乙酸溶解，離心除去殘渣，得濃縮液；C、用陰離子交換柱層析法對上述濃縮液進行洗脫后，進行凝膠過濾柱層析，即得。本發(fā)明提供一種具有工藝合理、操作方便實用、水蛭素成品的質(zhì)量穩(wěn)定性好和收率較高的特點，且能夠避免傳統(tǒng)方法對水蛭的一次性掠奪，保護了水蛭的野生資源，又帶動了水蛭養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。
【IPC分類】C07K14/815, A01K67/033
【公開號】CN104926937
【申請?zhí)枴緾N201510343680
【發(fā)明人】謝海林
【申請人】廣西復鑫益生物科技有限公司平南分公司
【公開日】2015年9月23日
【申請日】2015年6月19日