一種從水蛭唾液中提取水蛭素的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及一種從水蛭唾液中提取水蛭素的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]水蛭素是水蛭體內(nèi)的一種蛋白質(zhì)，含65個氨基酸殘基和3對二硫鍵，具有高度特異的抗凝血酶活性，抑制凝血酶結(jié)合底物，故有抗凝血作用。
[0003]天然水蛭素的分離與純化主要包括從活體水蛭素和干水蛭中分離提取水蛭素。傳統(tǒng)的水蛭素的獲得是對水蛭的一次性掠奪，對水蛭的野生資源造成巨大的浪費，不利于水蛭養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供一種具有工藝合理、操作方便實用、水蛭素成品的質(zhì)量穩(wěn)定性好和收率較高的特點，且能夠避免傳統(tǒng)方法對水蛭的一次性掠奪，保護了水蛭的野生資源，又帶動了水蛭養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。
[0005]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
一種從水蛭唾液中提取水蛭素的方法，包括以下步驟:
A、將水蛭置于容器中充分饑餓，投入誘導(dǎo)物質(zhì)至水蛭吸飽后，加入催吐劑使其吐出體內(nèi)的唾液即天然水蛭素粗品液體，然后取出吸血水蛭活體并將其沖洗干凈后返回飼養(yǎng)池繼續(xù)飼養(yǎng)；同時收集容器內(nèi)的水蛭素粗品液體，置冰箱中冷凍保存待用；
所述的誘導(dǎo)物質(zhì)由蚯蚓提取液10?300ml、殼聚糖5?50g、黃芪多糖I?20g、葡萄糖粉I?30g組成；
所述的催吐劑為硫酸鋅與乙醇的混合液，其比例為1:1~2，催吐劑的用量與水蛭活體之間的重量比為1:1?10 ；
B、解凍上述水蛭素粗品，取250~300ml加進(jìn)4倍置冰箱中4°C下預(yù)冷的含15%水的冷丙酮中，攪拌后置冰箱中4°C下讓其沉淀過夜，次日吸出上清丙酮并離心，在所得沉淀中加入預(yù)冷的三氯乙酸20-30ml使其溶解，離心除去殘渣，得唾液腺分泌物濃縮液；
C、用陰離子交換柱層析法對上述唾液腺分泌物濃縮液進(jìn)行洗脫后，進(jìn)行凝膠過濾柱層析，即得。
[0006]所述的水蛭充分饑餓的時間為15?20天，水蛭吸飽誘導(dǎo)物質(zhì)的時間為10?60分鐘。
[0007]所述的硫酸鋅質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05-1%,所述的乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5~10%。
[0008]所述的步驟C中陰離子交換柱層析法的具體操作如下:
取適量二乙基氨基纖維素陰離子交換劑加蒸餾水使其膨脹，依次用0.5mol/L的NaOH-NaCl混合液、0.5mol/L的HCl及0.5mol/L的NaOH-NaCl混合液各浸泡300分鐘后用蒸飽水洗滌至中性；裝柱2cm X 60cm至所需高度，用pH=4.6的0.lmol/L梓檬酸鈉緩沖液平衡；用5ml的唾液腺分泌物濃縮液或上述三氯乙酸溶液上樣進(jìn)行梯度洗脫并用核酸蛋白檢測儀記錄繪制出洗脫曲線，分段收集洗脫液，流速為30ml/小時；經(jīng)檢測將有活力部分集中于透析袋中用甘油濃縮，即得。
[0009]所述的步驟C中凝膠過濾柱層析的具體操作如下:
取適量的交聯(lián)葡聚糖離子交換劑加蒸餾水浸泡4小時，用0.5mol/L NaOH-0.5mol/LNaCl混合液浸泡半小時，抽濾除去鹼液并用蒸餾水洗滌至中性，加熱煮沸除去氣泡；裝柱1.5cm X 50cm至所需高度，用pH=7.4的0.lmol/L Tris-HCl-NaCl緩沖液平衡，將上述有活力洗脫液的透析袋甘油濃縮液上樣洗脫，分段收集洗脫液，流速為90ml/小時。
[0010]本發(fā)明的有益效果如下:
1.本發(fā)明的誘導(dǎo)物質(zhì)是一種純天然的誘導(dǎo)液，誘導(dǎo)液中的成分無毒、無害、無腐蝕性，這樣有利于天然水蛭素的提取和分離純化；誘導(dǎo)液中含蚯蚓提取液，其含有多種微量元素及活性酶類物質(zhì)，能夠誘導(dǎo)吸血水蛭吮吸。
[0011]2.本發(fā)明中的殼聚糖具有良好的營養(yǎng)價值和抑菌消炎防腐等作用，可有效提高在提取天然水蛭素粗品過程中吸血水蛭存活率。
[0012]3.本發(fā)明提高了吸血水蛭的免疫力，在特異性誘導(dǎo)液中添加了黃芪多糖和葡萄糖，這樣可為吸血水蛭及時補充其所需的營養(yǎng)和能量，這為反復(fù)進(jìn)行活體水蛭提取天然水蛭素粗品打下了堅實的基礎(chǔ)，同時，黃芪多糖為免疫促進(jìn)劑或調(diào)節(jié)劑，可增強機體免疫功能，改善機體腸道內(nèi)環(huán)境，促進(jìn)有益群菌乳酸桿菌的生長，以維持腸道微生態(tài)區(qū)系的平衡和穩(wěn)定，從而有利于防治各種病毒感染、細(xì)菌性疾病。黃芪多糖的加入可有效防治在提取天然水蛭素粗品過程中因擠壓損傷水蛭口腔而引起的條件性感染性疾病，從而提高了吸血水蛭提取其唾液即天然水蛭素粗品后的成活率，減少了死亡率，降低生產(chǎn)成本。
[0013]4.本發(fā)明工藝簡單，天然水蛭素的提取率穩(wěn)定，提取總量較高。采用本發(fā)明的方法，一條活體水蛭可多次提取天然水蛭素粗品，避免傳統(tǒng)方法對水蛭的一次性掠奪，保護了水蛭的野生資源，又帶動了水蛭養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。
【具體實施方式】
[0014]為了使本發(fā)明所述的內(nèi)容更加便于理解，下面結(jié)合【具體實施方式】對本發(fā)明所述的技術(shù)方案做進(jìn)一步的說明，但是本發(fā)明不僅限于此。
[0015]實施例1
本發(fā)明的從水蛭唾液中提取水蛭素的方法，包括以下步驟:
A、將水蛭置于容器中充分饑餓，投入誘導(dǎo)物質(zhì)至水蛭吸飽后，加入催吐劑使其吐出體內(nèi)的唾液即天然水蛭素粗品液體，然后取出吸血水蛭活體并將其沖洗干凈后返回飼養(yǎng)池繼續(xù)飼養(yǎng)；同時收集容器內(nèi)的水蛭素粗品液體，置冰箱中冷凍保存待用；
所述的誘導(dǎo)物質(zhì)由蚯蚓提取液10ml、殼聚糖5g、黃芪多糖lg、葡萄糖粉Ig組成；
所述的催吐劑為硫酸鋅與乙醇的混合液，其比例為1:1，催吐劑的用量與水蛭活體之間的重量比為1:1 ;
B、解凍上述水蛭素粗品，取250ml加進(jìn)4倍置冰箱中4°C下預(yù)冷的含15%水的冷丙酮中，攪拌后置冰箱中4°C下讓其沉淀過夜，次日吸出上清丙酮并離心，在所得沉淀中加入預(yù)冷的三氯乙酸20ml使其溶解，離心除去殘渣，得唾液腺分泌物濃縮液；
C、用陰離子交換柱層析法對上述唾液腺分泌物濃縮液進(jìn)行洗脫后，進(jìn)行凝膠過濾柱層析，即得。
[0016]所述的水蛭充分饑餓的時間為15天，水蛭吸飽誘導(dǎo)物質(zhì)的時間為10分鐘。
[0017]所述的硫酸鋅質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%，所述的乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%。
[0018]所述的步驟C中陰離子交換柱層析法的具體操作如下:
取適量二乙基氨基纖維素陰離子交換劑加蒸餾水使其膨脹，依次用0.5mol/L的NaOH-NaCl混合液、0.5mol/L的HCl及0.5mol/L的NaOH-NaCl混合液各浸泡300分鐘后用蒸飽水洗滌至中性；裝柱2cm X 60cm至所需高度，用pH=4.6的0.lmol/L梓檬酸鈉緩沖液平衡；用5ml的唾液腺分泌物濃縮液或上述三氯乙酸溶液上樣進(jìn)行梯度洗脫并用核酸蛋白檢測儀記錄繪制出洗脫曲線，分段收集洗脫液，流速為30ml/小時；經(jīng)檢測將有活力部分集中于透析袋中用甘油濃縮，即得。
[0019]所述的步驟C中凝膠過濾柱層析的具體操作如下:
取適量的交聯(lián)葡聚糖離子交換劑加蒸餾水浸泡4小時，用0.5mol/L NaOH-0.5mol/LNaCl混合液浸泡半小時，抽濾除去鹼液并用蒸餾水洗滌至中性，加熱煮沸除去氣泡；裝柱1.5cm X 50cm至所需高度，用pH=7.4的0.lmol/L Tris-HCl-NaCl緩沖液平衡，將上述有活力洗脫液的透析袋甘油濃縮液上樣洗脫，分段收集洗脫液，流速為90ml/小時。
[0020]實施例2
本發(fā)明的從水蛭唾液中提取水蛭素的方法，包括以下步驟:
A、將水蛭置于容器中充分饑餓，投入誘導(dǎo)物質(zhì)至水蛭吸飽后，加入催吐劑使其吐出體內(nèi)的唾液即天然水蛭素粗品液體，然后取出吸血水蛭活體并將其沖洗干凈后返回飼養(yǎng)池繼續(xù)飼養(yǎng)；同時收集容器內(nèi)的水蛭素粗品液體，置冰箱中冷凍保存待用；
所述的誘導(dǎo)物質(zhì)由蚯蚓提取液100ml、殼聚糖25g、黃芪多糖10g、葡萄糖粉1g組成；所述的催吐劑為硫酸鋅與乙醇的混合液，其比例為1:1.5，催吐劑的用量與水蛭活體之間的重量比為1:5 ;
B、解凍上述水蛭素粗品，取280ml加進(jìn)4倍置冰箱中4°C下預(yù)冷的含15%水的冷丙酮中，攪拌后置冰箱中4°C下讓其沉淀過夜，次日吸出上清丙酮并離心，在所得沉淀中加入預(yù)冷的三氯乙酸25ml使其溶解，離心除去殘渣，得唾液腺分泌物濃縮液；
C、用陰離子交換柱層析法對上述唾液腺分泌物濃縮液進(jìn)行洗脫后，進(jìn)行凝膠過濾柱層析，即得。
[0021]所述的水蛭充分饑餓的時間為15?20天，水蛭吸飽誘導(dǎo)物質(zhì)的時間為30分鐘。
[0022]所述的硫酸鋅質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%，所述的乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%。
[0023]所述的步驟C中陰離子交換柱層析法的具體操作如下:
取適量二乙基氨基纖維素陰離子交換劑加蒸餾水使其膨脹，依次用0.5mol/L的NaOH-NaCl混合液、0.5mol/L的HCl及0.5mol/L的NaOH-NaCl混合液各浸泡300分鐘后用蒸飽水洗滌至中性；裝柱2cm X 60cm至所需高度，用pH=4.6的0.lmol/L梓檬酸鈉緩沖液平衡；用5ml的唾液腺分泌物濃縮液或上述三氯乙酸溶液上樣進(jìn)行梯度洗脫并用核酸蛋白檢測儀記錄繪制出洗脫曲線，分段收集洗脫液，流速為30ml/小時；經(jīng)檢測將有活力部分集中于透析袋中用甘油濃縮，即得。
[0024]所述的步驟C中凝膠過濾柱層析的具體操作如下:
取適量的交聯(lián)葡聚糖離子交換劑加蒸餾水浸泡4小時，用0.5mol/L NaOH-0.5mol/LNaCl混合液浸泡半小時，抽濾除去鹼液并用蒸餾水洗滌至中性，加熱煮沸除去氣泡；裝柱1.5cm X 50cm至所需高度，用pH=7.4的0.lmol/L Tris-HCl-NaCl緩沖液平衡，將上述有活力洗脫液的透析袋甘油濃縮液上樣洗脫，分段收集洗脫液，流速為90ml/小時。
[0025]實施例3
本發(fā)明的從水蛭唾液中提取水蛭素的方法，包括以下步驟:
A、將水蛭置于容器中充分饑餓，投入誘導(dǎo)物質(zhì)至水蛭吸飽后，加入催吐劑使其吐出體內(nèi)的唾液即天然水蛭素粗品液體，然后取出吸血水蛭活體并將其沖洗干凈后返回飼養(yǎng)池繼續(xù)飼養(yǎng)；同時收集容器內(nèi)的水蛭素粗品液體，置冰箱中冷凍保存待用；
所述的誘導(dǎo)物質(zhì)由蚯蚓提取液200ml、殼聚糖40g、黃芪多糖15g、葡萄糖粉20g組成；所述的催吐劑為硫酸鋅與乙醇的混合液，其比例為1:1，催吐劑的用量與水蛭活體之間