Taq? (2χ ) 10μ1 PCR Forward Primer ( ΙΟμηι) 0.4μΙ PCR Reverse Primer (10'um) 0·4μΙ cDNA 模板 2_0μΙ ClH2O 7.2μΙ Total 20μΙ
[0172] 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)步驟
[0173] 1 94 °C 5 min 2 95 C ] 0 see
[0174] 3 58 iC 30 see 4 721C 20 see 5 Plate read 6 82°C 30 see 7 Plate read 8 Go to step 2 for more 39 times 9 Perform melting curve from 55.O C to 95f〇 C, read every 0.2 C, hold for I see
[0175] 反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的擴(kuò)增曲線和熔解曲線，各基因的表達(dá)強(qiáng)度根 據(jù) CT值（threshold cycle values)、內(nèi)參基因（GAPDH)標(biāo)化后，采用 group t-test 檢驗(yàn)計(jì) 算P值。
[0176] 2.結(jié)果
[0177] 這三個(gè)shRNA載體轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞5-8F、HKl和HNE2后，均可顯著下調(diào)鼻咽癌細(xì) 胞中AFAP1-AS1的表達(dá)水平（圖4)。
[0178] 實(shí)施例4,制備荷載shRNA干擾載體的納米顆粒抑制鼻咽癌細(xì)胞中AFAP1-AS1的表 達(dá)
[0179] 1.材料方法
[0180] 1. 1制備多聚賴氨酸包被的硅納米顆粒
[0181] 多聚賴氨酸包被的硅納米顆粒是運(yùn)用OPlO/環(huán)己烷/氨水微乳液自組裝技術(shù)進(jìn)行 娃納米顆粒（silica nanoparticle, SiNP)的合成，并利用娃納米顆粒的表面能和通過離 子靜電作用，制備多聚賴氨酸修飾的硅納米顆粒；所述的納米顆粒可以由以下方法制備得 到：
[0182] 1)將0P-10、環(huán)己烷和氨水混合，室溫?cái)嚢杈鶆蚝蠹尤胝杷岙愼ィ═EOS)，繼續(xù)攪 拌至聚合完成，加入等體積丙酮，超聲分散，離心，雙蒸水洗滌三次，離心收集沉淀于80°C干 燥，研細(xì)得硅納米顆粒（SiNP)。其中H 2O與0P-10及H2O與TEOS的摩爾比為2~10、氨水 濃度為1. 6~28%、TEOS在環(huán)己烷中的摩爾濃度為0. 1~3mol/L。
[0183] 2)將SiNP按0· 1~10mg/ml重懸于0· 6M恥0)3溶液中，超聲分散，離心，棄上清， 再將沉淀物按0. 1~l〇mg/ml重懸于PBS (pH 7. 4)中，超聲分散，加多聚賴氨酸（終濃度為 4~15nmol/mL)，充分混勾，室溫混搖；離心，棄上清，沉淀重懸于雙蒸水中，得到多聚賴氨 酸修飾的娃納米顆粒。多聚賴氨酸的終濃度為4~15nmol/mL。
[0184] 3)將改性硅納米顆粒超聲分散，按質(zhì)量比5~30:1與實(shí)施例3中所述的靶向 AFAP1-AS1的RNA干擾載體混合，室溫靜置使其結(jié)合。
[0185] 1.2細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染
[0186] 將生長狀態(tài)良好的鼻咽癌細(xì)胞5-8F、HK2和HNE2按2X IO5個(gè)細(xì)胞/孔接種于6 孔板中，將6孔板置于37 °C，5 % 0)2培養(yǎng)箱中，待培養(yǎng)細(xì)胞生長至50-70 %密度即可開始 AFAP1-AS1真核表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)染過程如下：
[0187] 在無菌EP管中加入100 μ 1制備好的攜帶AFAP1-AS1真核表達(dá)質(zhì)粒的多聚賴氨酸 修飾的硅納米顆粒懸液，與100 μ 1無血清培養(yǎng)基溫和混勻；用D-Hank' s液洗滌細(xì)胞3次； 將上述混合物中加入800 μ 1無血清培養(yǎng)基（無抗生素），溫和混勻后加入6孔板中的1個(gè) 孔；將6孔板置于CO2培養(yǎng)箱中，37°C培養(yǎng)6小時(shí)，然后棄上清，加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)過 夜。用攜帶Scramble序列的多聚賴氨酸修飾的娃納米顆粒作為實(shí)驗(yàn)對照。
[0188] 1.3細(xì)胞穿膜實(shí)驗(yàn)
[0189] 細(xì)胞穿膜（(transwell)實(shí)驗(yàn)是驗(yàn)證腫瘤細(xì)胞侵襲能力的實(shí)驗(yàn)方法。Transwell小 室（孔徑8 μπι)及基質(zhì)膠（Matrigel)購自美國BD公司，4%多聚甲醛固定液、結(jié)晶紫染液 (0· 1 % g/ml)購自Sigma公司。將Matrigel按1:8稀釋，包被在Transwell小室底部膜的 上室面，置37°C 30分鐘使Matrigel聚合成凝膠。使用前按BD公司說明書進(jìn)行基質(zhì)膠膜水 化。
[0190] 在每個(gè)Transwell小室上層加入無血清培養(yǎng)基和I X IO5個(gè)轉(zhuǎn)染了 AFAPl-ASlshRNA干擾載體或?qū)φ蛰d體（scramble)的鼻咽癌細(xì)胞，在Transwell小室下層加 入含20%胎牛血清的培養(yǎng)基。細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)36小時(shí)后，用4%多聚甲醛固定液固定，結(jié)晶 紫染色，用棉簽輕輕擦掉上層未迀移細(xì)胞，用PBS洗3遍。在顯微鏡下觀察穿過基質(zhì)膠膜的 鼻咽癌細(xì)胞。
[0191] 1.4細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)
[0192] 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)是驗(yàn)證腫瘤細(xì)胞迀移能力的實(shí)驗(yàn)方法。轉(zhuǎn)染了 AFAPl-ASlshRNA干 擾載體或?qū)φ蛰d體（scramble)的鼻咽癌細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞密度達(dá)到90 %時(shí)，用 200ul pipet在每個(gè)6孔板中劃一條直線（劃痕），隨后在0、8、12、16、24、32、48小時(shí)等各 個(gè)時(shí)間點(diǎn)（視不同細(xì)胞迀移能力而定）在顯微鏡下觀察劃痕愈合情況，拍照，并計(jì)算各組細(xì) 胞迀移速度。
[0193] 2.結(jié)果
[0194] 2. 1在鼻咽癌細(xì)胞中導(dǎo)入AFAP1-AS1的干擾載體抑制AFAP1-AS1后，細(xì)胞侵襲能 力降低
[0195] 細(xì)胞穿膜（transwell)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在鼻咽癌細(xì)胞系5-8F、HKl和HNE2中轉(zhuǎn)入靶向 AFAP1-AS1的干擾載體，抑制AFAP1-AS1的表達(dá)后，能穿過基質(zhì)膠膜的鼻咽癌細(xì)胞數(shù)目顯著 減少，表明細(xì)胞侵襲能力降低（圖5)。
[0196] 2. 2在鼻咽癌細(xì)胞中導(dǎo)入AFAP1-AS1的干擾載體抑制AFAP1-AS1表達(dá)后，細(xì)胞迀 移能力降低
[0197] 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在鼻咽癌細(xì)胞系5-8F、HKl和HNE2中轉(zhuǎn)入靶向AFAP1-AS1的 干擾載體，抑制AFAP1-AS1的表達(dá)后，鼻咽癌細(xì)胞從劃痕兩邊往劃痕中央迀移的速度減慢， 劃痕愈合的時(shí)間延長，表明細(xì)胞運(yùn)動(dòng)迀移能力降低（圖6)。
[0198] 實(shí)施例5,裸鼠轉(zhuǎn)移瘤模型證實(shí)抑制AFAP1-AS1的表達(dá)可以抑制鼻咽癌細(xì)胞的轉(zhuǎn) 移能力
[0199] 1.材料與方法
[0200] 16只雄性BALB/C裸鼠，4周齡，重量為19±2g，購買于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限 公司。所有裸鼠均質(zhì)檢合格，在中南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部于無特定病原體（SPF)條件下飼養(yǎng)。 AFAP1-AS1干擾載體構(gòu)建及多聚賴氨酸修飾的硅納米顆粒的制備、細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染等同實(shí) 施例4。轉(zhuǎn)染AFAP1-AS1干擾載體或scramble載體（NC)的5-8F細(xì)胞各取I X IO6個(gè)，經(jīng)尾 靜脈注入裸鼠體內(nèi)（8只每組），10周后處死裸鼠，觀察鼻咽癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移情況（主要轉(zhuǎn)移 到裸鼠肺中）。
[0201] 2.結(jié)果
[0202] 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)干擾AFAP1-AS1的表達(dá)可抑制鼻咽癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力（圖 7)。與對照組（NC)相比，敲低AFAP1-AS1的5-8F細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移灶的數(shù)目（圖7A-C，P〈0. 05) 變少，轉(zhuǎn)移灶的體積變?。▓D7D)，表明鼻咽癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力受到明顯抑制。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.長鏈非編碼RNAAFAP1-AS1的應(yīng)用方法，其特征在于，用于制備鼻咽癌輔助診斷或者 療效預(yù)測的實(shí)時(shí)熒光定量檢測試劑，該長鏈非編碼RNA AFAP1-AS1的序列如SEQ NO: 1所 不O2. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用方法，其特征在于，所述的實(shí)時(shí)熒光定量檢測試劑中包 含用于實(shí)時(shí)熒光定量檢測AFAP1-AS1表達(dá)的引物序列： 正向引物：5'-AATGGTGGTAGGAGGGAGGA-3'， 反向引物：5'-CACACAGGGGAATGAAGAGG-3'。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用方法，其特征在于，所述的實(shí)時(shí)熒光定量檢測制劑為 試劑盒。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用方法，其特征在于，試劑盒中含有： 用于實(shí)時(shí)熒光定量檢測AFAP1-AS1表達(dá)的引物序列： 正向引物：5'-AATGGTGGTAGGAGGGAGGA-3'， 反向引物：5'-CACACAGGGGAATGAAGAGG-3'。 內(nèi)參基因GAPDH特異性PCR引物： 正向引物5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3' 反向引物5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'。5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用方法，其特征在于， 試劑盒中還含有： (1)從鼻咽癌組織中抽提總RNA所用試劑，包括RNA穩(wěn)定溶液、Trizol試劑、三氯甲烷、 異丙醇、無酶水； (2)以總RNA為模板將LncRNA AFAP1-AS1逆轉(zhuǎn)錄為cDNA所用試劑，包括逆轉(zhuǎn)錄緩沖 液、三磷酸堿基脫氧核苷酸、RNA酶抑制劑、MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶以及隨機(jī)引物； (3)將cDNA實(shí)時(shí)定量PCR所用試劑，包括實(shí)時(shí)熒光定量SYBR染料、無酶水。6. 用于制備鼻咽癌輔助診斷或者療效預(yù)測的制劑的引物序列： 正向引物：5'-AATGGTGGTAGGAGGGAGGA-3'， 反向引物：5'-CACACAGGGGAATGAAGAGG-3'。7.用于鼻咽癌輔助診斷或者療效預(yù)測的實(shí)時(shí)熒光定量檢測試劑，是包含有權(quán)利要求6 所述的引物的試劑盒。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的實(shí)時(shí)熒光定量檢測試劑，其特征在于，試劑盒中還含有內(nèi)參 基因GAPDH特異性PCR引物： 正向引物5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3' 反向引物5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的實(shí)時(shí)熒光定量檢測試劑，其特征在于，試劑盒中還含有： (1)從鼻咽癌組織中抽提總RNA所用試劑，包括RNA穩(wěn)定溶液、Trizol試劑、三氯甲烷、 異丙醇、無酶水； (2)以總RNA為模板將LncRNA AFAP1-AS1逆轉(zhuǎn)錄為cDNA所用試劑，包括逆轉(zhuǎn)錄緩沖 液、三磷酸堿基脫氧核苷酸、RNA酶抑制劑、MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶以及隨機(jī)引物； (3)將cDNA實(shí)時(shí)定量PCR所用試劑，包括實(shí)時(shí)熒光定量SYBR染料、無酶水。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種長鏈非編碼RNA AFAP1-AS1的引物、檢測試劑及其應(yīng)用，即用于制備鼻咽癌患者的輔助診斷和預(yù)后制劑，特別是制備出實(shí)時(shí)熒光定量分析法預(yù)測鼻咽癌患者預(yù)后的試劑盒。通過研究證實(shí)AFAP1-AS1在鼻咽癌組織中表達(dá)上調(diào)，高表達(dá)AFAP1-AS1的鼻咽癌患者比低表達(dá)AFAP1-AS1的鼻咽癌患者預(yù)后差，因此，將AFAP1-AS1的表達(dá)用于鼻咽癌患者的預(yù)后預(yù)測，可以為鼻咽癌患者的預(yù)后提供強(qiáng)有力的分子生物學(xué)依據(jù)，具有深遠(yuǎn)的臨床意義和重要的推廣應(yīng)用前景。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N15/11
【公開號】CN104894244
【申請?zhí)枴緾N201510238836
【發(fā)明人】曾朝陽, 孛昊, 李桂源, 熊煒, 李小玲, 李夏雨, 龔朝建, 陽劍波, 廖前進(jìn), 陳攀, 喻建軍, 石磊
【申請人】中南大學(xué)
【公開日】2015年9月9日
【申請日】2015年5月12日