用于制造生物醇的改性細(xì)菌的制作方法
【專利說明】用于制造生物醇的改性細(xì)菌 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及對(duì)天然途徑進(jìn)行工程改造以增強(qiáng)細(xì)菌中的生物醇制造的生物醇制造 領(lǐng)域。更具體而言，本發(fā)明提供能夠使己糖和戊糖發(fā)酵的改性細(xì)菌、獲得這樣的改性細(xì)菌的 方法和對(duì)具有己糖和戊糖的木質(zhì)纖維素生物質(zhì)進(jìn)行發(fā)酵的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 人們?cè)诤艽蟪潭壬弦蕾囉诨剂蟻頋M足我們的能量需求。生物醇、特別是乙醇 是替代至少部分石油的有吸引力的替代運(yùn)輸燃料。來自可再生源的燃料如農(nóng)業(yè)和林業(yè)殘余 物保持了降低其對(duì)化石燃料的依賴性而不與食物競(jìng)爭(zhēng)的希望。農(nóng)業(yè)和林業(yè)廢棄物大部分 由木質(zhì)纖維素構(gòu)成，所述木質(zhì)纖維素由被半纖維素和木質(zhì)素包圍的高度結(jié)構(gòu)化的纖維素組 成。原理上，將木質(zhì)纖維素分解成單糖并將其發(fā)酵成乙醇是可能的。然而，與該過程相關(guān)的 成本是商業(yè)應(yīng)用的主要障礙。從木質(zhì)纖維素生物質(zhì)進(jìn)行乙醇制造的經(jīng)濟(jì)性的關(guān)鍵進(jìn)展之一 將會(huì)是將在木質(zhì)纖維素水解之后釋放的己糖和戊糖有效發(fā)酵成乙醇。
[0003] 令人遺憾的是，用于乙醇發(fā)酵的常規(guī)微生物如釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)和運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌（Zymomonasmobilis)不具有利用戊糖的能力。已經(jīng)嘗試 將來自其它微生物的用于戊糖降解途徑的基因轉(zhuǎn)移進(jìn)釀酒酵母和運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌。然而， 與大規(guī)模的外源基因表達(dá)相關(guān)的缺點(diǎn)如不穩(wěn)定性、毒性、遏制等阻止了其廣泛的用途。另一 方面，大腸桿菌（Escherichiacoli)具有對(duì)己糖和戊糖兩者進(jìn)行發(fā)酵的能力并且被用于通 過各種基因操縱來制造乙醇。已經(jīng)嘗試了不引入外源基因的大腸桿菌的基因操縱并取得了 一些成功，并且這些技術(shù)在經(jīng)改造的菌株的長(zhǎng)期基因穩(wěn)定性方面具有優(yōu)點(diǎn)。
[0004] 在厭氧條件下，大腸桿菌通過涉及丙酮酸甲酸裂解酶（PFL)的途徑來制造乙醇， 所述丙酮酸甲酸裂解酶（PFL)將丙酮酸轉(zhuǎn)化成乙酰輔酶A和甲酸（圖1)。然而，該途徑不 是氧化還原平衡的，原因是在將1摩爾葡萄糖代謝成乙醇的過程中，消耗4摩爾NADH，但是 僅產(chǎn)生2摩爾NADH。該氧化還原不平衡性會(huì)對(duì)乙醇的收率產(chǎn)生不利影響。然而，存在其中 將葡萄糖轉(zhuǎn)化成乙醇或丁醇的過程為氧化還原平衡過程的替代途徑。這時(shí)，丙酮酸經(jīng)由丙 酮酸脫氫酶復(fù)合物（PDH)轉(zhuǎn)化成乙酰輔酶A和CO2，并且在該過程中產(chǎn)生1摩爾NADH。然 而，PDH的表達(dá)在厭氧條件下被抑制，而在需氧生長(zhǎng)的細(xì)胞中保持活性。為了在厭氧條件下 激活TOH的表達(dá)，PDH的啟動(dòng)子應(yīng)當(dāng)用在厭氧條件下有高度活性的啟動(dòng)子替代。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)， 用PFL啟動(dòng)子替代PDH啟動(dòng)子的嘗試不是非常成功，因?yàn)楸M管在厭氧條件下表現(xiàn)出增強(qiáng)的 PDH表達(dá)和增加的乙醇收率，但是乙醇凈生產(chǎn)率低。
[0005] 因而，需要能夠?qū)禾呛臀焯莾烧哌M(jìn)行發(fā)酵來以高生產(chǎn)率制造生物醇如乙醇的具 有基因改變的改性細(xì)菌菌株。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 相應(yīng)地，在一般性方面中，本發(fā)明提供細(xì)菌中的天然途徑改造以增強(qiáng)通過對(duì)己糖 和戊糖發(fā)酵來進(jìn)行的生物醇制造。
[0007] 在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供能夠?qū)禾呛臀焯莾烧哌M(jìn)行發(fā)酵以制造生物醇的改性 細(xì)菌菌株。
[0008] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供能夠?qū)禾呛臀焯莾烧哌M(jìn)行發(fā)酵以由木質(zhì)纖維素 生物質(zhì)制造生物乙醇的改性細(xì)菌菌株。
[0009] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供其中一種基因的啟動(dòng)子可以被在厭氧條件下表達(dá) 的另一種基因的啟動(dòng)子替代的改性細(xì)菌菌株。
[0010] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種改性的大腸桿菌菌株，其中大腸桿菌通過一 種基因的啟動(dòng)子被在厭氧條件下表達(dá)的另一種基因的啟動(dòng)子替代來改性。
[0011] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種改性的大腸桿菌菌株，其中丙酮酸脫氫酶操 縱子（PDH)的啟動(dòng)子被在厭氧條件下表達(dá)的基因的啟動(dòng)子替代。
[0012] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種改性的大腸桿菌菌株，其中丙酮酸脫氫酶操 縱子（PDH)的啟動(dòng)子被選自frdA、ldhA、pflB、adhE和gapA的基因的啟動(dòng)子替代。
[0013] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種改性的細(xì)菌菌株，其中丙酮酸脫氫酶操縱子 O3DH)的啟動(dòng)子被gapA啟動(dòng)子替代。
[0014] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種改性的大腸桿菌菌株，其中導(dǎo)致競(jìng)爭(zhēng)產(chǎn)物的 基因被刪除，所述競(jìng)爭(zhēng)產(chǎn)物由乳酸、琥珀酸、乙酸和甲酸構(gòu)成。
[0015] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種改性的細(xì)菌菌株，其中導(dǎo)致競(jìng)爭(zhēng)產(chǎn)物的一種 或更多種基因的基礎(chǔ)水平表達(dá)可以被再次引入。
[0016] 在一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種獲得能夠?qū)禾呛臀焯莾烧哌M(jìn)行發(fā)酵以制造生物醇 的改性細(xì)菌菌株的方法。
[0017] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種獲得改性的大腸桿菌菌株的方法，其中所述 方法包括以下步驟：
[0018]a.用在厭氧條件下以高水平表達(dá)的基因的啟動(dòng)子替代丙酮酸脫氫酶操縱子 O3DH)的啟動(dòng)子；
[0019]b.通過刪除導(dǎo)致競(jìng)爭(zhēng)產(chǎn)物的基因引入突變，所述競(jìng)爭(zhēng)產(chǎn)物為乳酸、琥珀酸、乙酸和 甲酸，和
[0020] c.再次引入編碼乙酸激酶的基因的基礎(chǔ)水平表達(dá)。
[0021] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種獲得改性細(xì)菌菌株的方法，其中用選自frdA、 ldhA、pflB、adhE和gapA的基因的啟動(dòng)子替代丙酮酸脫氫酶操縱子（PDH)的啟動(dòng)子。
[0022] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種獲得改性細(xì)菌菌株的方法，其中用gapA基因 的啟動(dòng)子替代I3DH的啟動(dòng)子。
[0023] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種利用改性的大腸桿菌菌株對(duì)己糖和/或戊糖 進(jìn)行發(fā)酵以制造生物醇的方法。
[0024] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種通過利用改性的細(xì)菌菌株來對(duì)包含己糖和戊 糖的木質(zhì)纖維素生物質(zhì)進(jìn)行發(fā)酵的方法。
[0025] 在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，通過利用改性的細(xì)菌菌株在需氧、微需氧和/或厭 氧條件下對(duì)包含在木質(zhì)纖維素生物質(zhì)中的己糖和戊糖進(jìn)行發(fā)酵以制造生物醇的方法。
[0026] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種利用改性的大腸桿菌菌株對(duì)木質(zhì)纖維素生物 質(zhì)進(jìn)行發(fā)酵的方法，其中所述方法包括以下步驟：
[0027]-使包含己糖和戊糖的木質(zhì)纖維素生物質(zhì)水解；
[0028]-將改性的大腸桿菌菌株與經(jīng)水解的包含己糖和戊糖的木質(zhì)纖維素生物質(zhì)混合；
[0029]-使混合物在微需氧條件下進(jìn)行發(fā)酵。
【附圖說明】
[0030]圖1是顯示在葡萄糖和木糖發(fā)酵期間大腸桿菌在厭氧條件下起作用的代謝途徑 的圖。
[0031] 圖2A是顯示啟動(dòng)子經(jīng)改造的大腸桿菌B菌株（SSY01-05)的功能特性和PDH操縱 子啟動(dòng)子替代對(duì)丙酮酸脫氫酶活性的影響的圖。
[0032] 圖2B是顯示啟動(dòng)子經(jīng)改造的大腸桿菌B菌株（SSY01-05)的功能特性和PDH操縱 子啟動(dòng)子替代對(duì)乙醇制造的影響的圖。
[0033] 圖3是顯示刪除SSY05的突變體的產(chǎn)物收率比較的圖。
[0034] 圖4A是顯示在經(jīng)改造的SSY09菌株中在ack基因的基礎(chǔ)水平表達(dá)上的細(xì)胞生長(zhǎng) 改善的圖。SSY09菌株利用pZSack改造，并且在LB培養(yǎng)基+2. 5g/l葡萄糖中生長(zhǎng)。
[0035] 圖4B是顯示在經(jīng)改造的SSY09菌株中在ack基因的基礎(chǔ)水平表達(dá)上的細(xì)胞生長(zhǎng) 改善的圖。SSY09菌