一條cd環(huán)和e螺旋區(qū)突變的瘦素活性肽及其編碼基因和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于生物化學(xué)與分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體設(shè)及一條CD環(huán)和E螺旋區(qū)突變的瘦 素活性膚及其編碼基因和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】：
[0002] 肥胖是人類健康最大的敵人之一，既是一個獨立的疾病，又是II型糖尿病、屯、血管 病、高血壓、腦中風(fēng)和多種癌癥的致病誘因，被世界衛(wèi)生組織列為導(dǎo)致疾病負擔(dān)的十大威脅 之一，是不容忽視的全球性的問題。據(jù)報道，全世界每年約有1800萬人死于由糖尿病和高 血壓引發(fā)的屯、腦血管疾病，而肥胖是糖尿病和高血壓的關(guān)鍵致病因素。肥胖癥嚴(yán)重危害了 人類的健康，給社會造成巨大的損失。據(jù)報道2003年，我國因為肥胖、糖尿病等慢性疾病的 支出就達到1. 2萬億元，占GDP的10. 3%。增長速度已經(jīng)高于國民生產(chǎn)總值的增長速度。 目前國內(nèi)減肥市場需求十分廣闊，2010年減肥品消費額達600億元，而與肥胖癥有直接或 間接關(guān)系的疾病如糖尿病、屯、血管疾病等所造成的損失更是無法估計。目前用于肥胖癥和 糖尿病治療的藥物-非諾貝特和羅格列酬，雖然能夠起到降低血脂和血糖的作用，但是長 期服用會對人體造成嚴(yán)重的副作用，如膜島素耐受和=致作用等，因此臨床上肥胖癥和糖 尿病的治療急需安全、高效、廉價的新型藥物。
[0003] 瘦素（Leptin)是由脂肪組織分泌的激素類物質(zhì)，通過六種Leptin受體參與機體 的脂肪代謝和食欲調(diào)節(jié)。本世際初期，瘦素被發(fā)現(xiàn)并且在肥胖老鼠模型上試驗獲得成功，弓I 起科學(xué)界的轟動，預(yù)示著生物技術(shù)為全球數(shù)億的肥胖患者找到了減肥新藥。1999年科學(xué)家 研究發(fā)現(xiàn)，人源瘦素蛋白的第116 - 130個氨基酸組織的多膚片段具有明顯的脂肪降解活 性。隨后，美國科學(xué)家率先進行第一次瘦素蛋白人體實驗，然而在73個受試的肥胖患者中， 大部分患者的減肥效果不明顯，只有2名患者在24周內(nèi)減去35磅，該說明用野生型人源瘦 素蛋白很難得到理想的減肥效果。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0004] 本發(fā)明的第一個目的是提供一種具有非常好的脂肪細胞降解活性的CD環(huán)和E螺 旋區(qū)突變的瘦素活性膚。
[0005] 本發(fā)明的CD環(huán)和E螺旋區(qū)突變的瘦素活性膚，其氨基酸序列如SEQIDNO. 1所示。
[0006] 本發(fā)明的第二個目的是提供一種上述CD環(huán)和E螺旋區(qū)突變的瘦素活性膚的編碼 基因。
[0007] 本發(fā)明的第=個目的是提供上述CD環(huán)和E螺旋區(qū)突變的瘦素活性膚在制備降解 脂肪細胞藥物、減肥藥物或降血糖藥物中的應(yīng)用。
[000引本發(fā)明對人源Leptin的氨基酸序列進行修飾，W提高其脂肪降解的效率。利用化 學(xué)方法分別合成CD環(huán)和E螺旋區(qū)突變的瘦素活性膚，盡可能的降低蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)對其活 性的影響，從而提高對脂肪細胞的祀向性和降解作用，實際結(jié)果表明，本發(fā)明的CD環(huán)和E螺 旋區(qū)突變的瘦素活性膚的脂肪細胞降解活性明顯優(yōu)于陽性對照-人源瘦素蛋白化-LE巧和 市售藥物羅格列酬（R0siglitazone，Ros)，其降脂活性具有明顯的濃度依賴性和細胞分化 時期的依賴性，在脂肪細胞分化前期（Preadipocytes)、分化期值0-D2)和成熟脂肪細胞期 值9)S個時期的細胞裂解作用顯著優(yōu)于兩個陽性對照（H-LEP或羅格列酬），特別CD環(huán)和 E螺旋區(qū)突變的瘦素活性膚的降脂活性在D0-D2期，濃度為1(T6m效果最優(yōu)，從而為研制新 型、高效、廉價的減肥和降血糖藥物提供候選祀標(biāo)。
【附圖說明】：
[0009] 圖1是CD環(huán)和E螺旋區(qū)突變的瘦素活性膚的設(shè)計.A:W人源Leptin序列為模板 模擬構(gòu)建蛋白質(zhì)S維結(jié)構(gòu)圖；B:人源Leptin3號外顯子（上）與CD環(huán)和E螺旋區(qū)突變的 瘦素活性膚（下）的氨基酸序列比對及功能分區(qū).* ;突變位點；
[0010] 圖2是CD環(huán)和E螺旋區(qū)突變的瘦素活性膚活性分析.3T3-L1前脂肪細胞降脂活 性分析（MTT檢測）.陽P-E:CD環(huán)和E螺旋區(qū)突變的瘦素活性膚，其后的10-6、1〇-\ 10-11分別 指的是CD環(huán)和E螺旋區(qū)突變的瘦素活性膚的濃度為1(T6M、1(T9M、;H-LEP;人源瘦素蛋 白（陽性對照1)，1〇-9是指10-9M;Ros;羅格列酬Rosiglitazone(陽性對照。；Control; 陰性對照。Preadipocytes;誘導(dǎo)分化前期；D0-D2 ;誘導(dǎo)分化第0-2天（分化初期）；D9 ; 誘導(dǎo)分化第9天（成熟脂肪細胞期）。統(tǒng)計分析；a,陽性對照（H-LEP/Ros)vs.陰性對照 (Control)，陽性對照的脂肪細胞裂解活性顯著優(yōu)于陰性對照P<0. 05 ;b，PEP-EVS.H-LEP， 陽P-E的脂肪細胞裂解活性顯著優(yōu)于H-LEP，P<0. 05 ;c，PEP-Evs.Ros，陽P-E的脂肪細胞裂 解活性顯著優(yōu)于Ros,P<0. 05 ;*，P<0. 01。
【具體實施方式】：
[0011] W下實施例是對本發(fā)明的進一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。
[0012] 實施例1 ;
[0013] 1.材料與方法
[0014] 1. 1CD環(huán)和E螺旋區(qū)突變的瘦素活性膚的設(shè)計與合成
[0015] W人源Leptin氨基酸序列為模板，根據(jù)突變位點的親/疏水性質(zhì)變化情 況在其功能區(qū)域設(shè)計一條CD環(huán)和E螺旋區(qū)突變的瘦素活性膚，其氨基酸序列為： SCHLHWAPGLETLDSGVQEASGY(具體如SEQIDNO. 1所示）。CD環(huán)和E螺旋區(qū)突變的瘦素活性 膚交由上海生工生物工程有限公司合成，經(jīng)HPLC檢測，化學(xué)合成的CD環(huán)和E螺旋區(qū)突變的 瘦素活性膚的濃度>95. 23 %，滿足后續(xù)活性分析的要求。用質(zhì)譜法檢測合成CD環(huán)和E螺旋 區(qū)突變的瘦素活性膚的準(zhǔn)確性，確認其氨基酸序列為SCHLHWAPGLETLDSGVQEASGY(具體如 SEQIDNO. 1 所示）。
[0016] 1. 2瘦素活性膚的體外降脂活性分析
[0017] W 3T3-L1前脂肪細胞系為模型，在細胞水平分析合成CD環(huán)和E螺旋區(qū)突變的瘦 素活性膚的脂肪降解活性。具體操作如下：
[001引 1.2. 1實驗設(shè)計
[0019] (1)分組：
[0020] a:分化前期（Preadipoc}ftes);
[0021]b:分化初期D0-D2(誘導(dǎo)分化第0-2天）；
[002引C:成熟脂肪細胞D9 (誘導(dǎo)分化第9天）；
[0023] (2)瘦素多膚及對照
[0024]a.CD環(huán)和E螺旋區(qū)突變的瘦素活性膚（PEP-E);用純凈水稀釋成10-3M，-20°C保存 備用。實驗開始后，工作濃度為1(T6m、i〇41m3個濃度梯度。
[0025] b.陽性對照1 ;H-LEP，重組人源瘦素（L巧tin)蛋白（10221-HNAE，北京義翅神 州生物技術(shù)有限公司），用純凈水稀釋成1(T6m，-2(Tc保存?zhèn)溆谩嶒為_始后，工作濃度為 10-9M。
[0026]C.陽性對照 2 ;Ros，羅格列酬（Rosiglitazone,R2408,Sigma)，用DMSO稀釋成濃 度為2518yM的貶存液，-20°C保存?zhèn)溆?。實驗開始后，用細胞培養(yǎng)液稀釋成0. 5yM的工作 液。
[0027] d.陰性對照（Control);等量的PBS
[002引 （3)細胞分化誘導(dǎo)液
[0029] a.細胞分化誘導(dǎo)液I;含有0. 5uMIBMX(3-Isobut}d-l-methylxanthi ne, 15879,Sig