鬧羊花分離的二萜類化合物的抗腫瘤藥物及方法用圖
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及天然提取物藥物化學技術領域，特別涉及一種鬧羊花分離的二萜類化 合物的抗腫瘤藥物及方法用途。
【背景技術】
[0002] 羊擲躅（RhododendronmolleG.Don)為杜花科植物，分布于我國長江流域至南 部各地，生長于山坡、灌叢或草叢中。羊躑躅的花、果實和根等均可供藥用。花一般稱鬧羊 花，味辛，溫，有大毒，入肝經；具有定痛、驅風和除濕等功效，用于風濕頑痹，傷折疼痛，皮膚 頑癬。果實一般稱六軸子或八里麻，味苦，溫，有大毒，入肺、脾經；具有搜風止痛、止咳平喘 等功效，用于風寒濕痹，跌打損傷，咳喘。根味辛，溫，有毒，入脾經；具有祛風、止咳、散瘀和 止痛等功效，用于風寒濕痹，跌打損傷，痔漏，癬瘡?；瘜W研宄表明，二萜和黃酮類化合物是 羊躑躅花、果實和根等的主要成分，其中二萜類成分既是主要有效成分，也是其毒性成分。
[0003] 目前從羊躑躅的花、果實和根中分離得到并經結構確證的二萜類成分根據母 核主要分為兩大類：grayanane型和kalmanol型。Grayanane型代表性化合物包括： rhodomolleinXVI、rhodomolleinXVII、rhodomolleinXVIII、rhodojaponinIII、 rhodojaponinVI(DiterpenoidsfromtheFruitsofRhododendronmolle?J.Nat. Prod. 2000,63，1214_1217);rhodomosideA和rhodomosideB(DiterpenoidandPhenolic GlycosidesfromtherootsofRhododendronmolle)；rhodomolleinIX、rhodomollein X、rhodomolleinXI、rhodomolleinXII和rhodomolleinXIII(Diterpenoidsfromthe FlowersofRhododendronmolle，J.Nat.Prod. 2004,67,1903-1906);rhodomolinA和 rhodomolinB(GrayananeDiterpenoidsfromtheFlowersofRhododendronmollewith CytotoxicActivityagainstaSpodopterafrugiperdaCellLine，J.Nat.Prod. 2005， 68,924-926) ;seco-rhodomo1lone(DiterpenoidsfromtheFlowersofRhododendron molle，J.Nat.Prod. 2014, 77,1185-1192)。Kalmanol型代表性化合物包括：rhodomollein XV、kalmanol(DiterpenoidsfromtheFruitsofRhododendronmolle，J.Nat. Prod. 2000,63,1214-1217)和rhodomolleinXIV(DiterpenoidsfromtheFlowersof Rhododendronmolle，J.Nat.Prod. 2004,67,1903-1906)。代表性Grayanane型和kalmanol 型二萜化合物結構分別如圖1和圖2所示。
[0004] 鬧羊花為羊躑躅的干燥花，具有祛風除濕、散瘀定痛之功效，可用于風濕痹痛、偏 正頭痛、跌撲腫痛、頑癬[中華人民共和國藥典（一部）[S]，2010版]。其化學成分研究始 于二十世紀八十年代，研究內容主要集中于其二砲類化學成分^Grayanane型和kalmanol 型二萜類化合物主要通過液液萃取和不同類型填料的柱色譜法分離純化得到。典型的方法 為：第一步，不同濃度的醇溶液提取；第二步，提取物分散于水中，分別用石油醚、乙酸乙酯 和正丁醇萃取，分成不同極性段；第三步，取二萜類化合物集中的乙酸乙酯萃取物用正相硅 膠柱色譜、反相硅膠柱色譜、MCI微孔樹脂柱色譜或者凝膠柱色譜細分純化。
[0005] 鬧羊花中二萜類成分藥理活性篩選的報道較少，細胞毒活性研究更少。2005年， Zhong等報道了鬧羊花中兩個Grayanane型化合物rhodomolinsA和rhodomolinsB對斜 紋夜蛾細胞系Sf_9 的細胞毒作用，IC50 值在 12-80yg/mL(GrayananeDiterpenoidsfrom theFlowersofRhododendronmollewithCytotoxicActivityagainstaSpodoptera frugiperdaCellLine，J.Nat.Prod.2005,68,924_926)。目前尚未見鬧羊花中kalmanol 型二萜成分的活性報道。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術問題在于，在針對鬧羊花有效成分研宄中，從乙酸乙酯萃 取物中分離鑒定了一個新的kalmanol型二貓化合物，化學結構上為rhodomolleinXXIV5 位羥基和1位氫脫水產物，為首次報道，命名為kalmanene。細胞毒試驗表明，該化合物對腫 瘤細胞具有顯著的細胞毒作用，對正常細胞細胞毒作用相對較弱，可以作為制備抗腫瘤藥 物的活性成分。
[0007] 為解決上述技術問題，本發(fā)明提供了一種鬧羊花中分離的二萜類化合物，所述二 貓類化合物為kalmanol型二貓化合物，化學結構上為rhodomolleinXXIV5位羥基和1位 氫脫水產物。
[0008] 為解決上述技術問題，本發(fā)明還提供了 一種鬧羊花中分離的二萜類化合物，所述 二萜類化合物的制備方法包括：
[0009] 取鬧羊花，用二氯甲烷提取三次脫脂，過濾，收集濾渣；
[0010] 將濾渣用乙醇溶液提取三次，過濾，收集濾液，減壓濃縮得乙醇提取物；
[0011] 將乙醇提取物加水制成提取物水懸液，以石油醚萃取三次再次脫脂后，以乙酸乙 酯萃取三次，獲得的乙酸乙酯萃取液濃縮，再以飽和碳酸氫鈉水溶液萃取三次，取乙酸乙酯 相蒸干，獲得乙酸乙酯萃取物粗品；
[0012] 將粗品在硅膠上進行柱層析，用乙酸乙酯-乙醇梯度洗脫，獲得乙酸乙酯-乙醇洗 脫物，濃縮得浸膏E1;
[0013] 取浸膏E1再次進行硅膠柱層析，用二氯甲烷-甲醇等度洗脫，收集6-8柱體積洗 脫部位，濃縮得浸膏E2;
[0014] 取浸膏E2進行反相硅膠柱層析，用水-甲醇等度洗脫，收集4-5柱體積洗脫部位， 濃縮得浸膏E3;
[0015] 取浸膏E3用制備型高效液相色譜分離，用水-甲醇梯度洗脫，從水-甲醇洗脫部 位得到所述二萜類化合物。
[0016] 所述將濾渣用乙醇溶液提取三次，優(yōu)選為95%乙醇溶液；
[0017] 所述用乙酸乙酯-乙醇梯度洗脫，優(yōu)選為體積比30 : 1乙酸乙酯-乙醇；
[0018] 所述二氯甲烷-甲醇等度洗脫，優(yōu)選為體積比15 : 1二氯甲烷-甲醇；
[0019] 所述取浸膏E2進行反相硅膠柱層析，用水-甲醇等度洗脫，優(yōu)選為體積比55 : 45 水-甲醇；
[0020] 所述取浸膏E3用制備型高效液相色譜分離，用水-甲醇梯度洗脫，優(yōu)選為體積比 60 : 40水-甲醇。
[0021] 為解決上述技術問題，本發(fā)明又提供了一種從鬧羊花中提取二萜類化合物的方 法，所述方法包括：
[0022] 取鬧羊花，用二氯甲烷提取三次脫脂，過濾，收集濾渣；
[0023] 將濾渣用乙醇溶液提取三次，過濾，收集濾液，減壓濃縮得乙醇提取物；
[0024] 將乙醇提取物加水制成提取物水懸液，以石油醚萃取三次再次脫脂后，以乙酸乙 酯萃取三次，獲得的乙酸乙酯萃取液濃縮，再以飽和碳酸氫鈉水溶液萃取三次，取乙酸乙酯 相蒸干，獲得乙酸乙酯萃取物粗品；
[0025] 將粗品在硅膠上進行柱層析，用乙酸乙酯_乙醇梯度洗脫，獲得乙酸乙酯-乙醇洗 脫物，濃縮得浸膏E1;
[0026] 取浸膏E1再次進行硅膠柱層析，用二氯甲烷_甲醇等度洗脫，收集6-8柱體積洗 脫部位，濃縮得浸膏E2;
[0027] 取浸膏E2進行反相硅膠柱層析，用水-甲醇等度洗脫，收集4-5柱體積洗脫部位， 濃縮得浸膏E3;
[0028] 取浸膏E3用制備型高效液相色譜分離，用水-甲醇梯度洗脫，從水-甲醇洗脫部 位得到所述二萜類化合物。
[0029] 為解決上述技術問題，本發(fā)明再提供了一種如前述任一項所述二萜類化合物在制 備抗腫瘤藥物中的應用。
[0030] 所述的腫瘤可以為結腸癌細胞株HT-29、結腸癌細胞株HCT-8、肝癌細胞株 Bcl-7402、非小細胞肺癌細胞株A549和/或乳腺癌細胞株MCF-7。
[0031] 為解決上述技術問題，本發(fā)明另提供了一種如前述任一項所述二萜類化合物在檢 測抗腫瘤藥物的活性中的應用。
[0032] 所述的腫瘤可以為結腸癌細胞株HT-29、結腸癌細胞株HCT-8、肝癌細胞株 Bcl-7402、非小細胞肺癌細胞株A549和/或乳腺癌細胞株MCF-7。
[0033] 為解決上述技術問題，本發(fā)明還提供了一種如前述任一項所述二萜類化合物在篩 選抗腫瘤藥物中的應用。
[0034] 所述的腫瘤可以為結腸癌細胞株HT-29、結腸癌細胞株HCT-8、肝癌細胞株 Bcl-7402、非小細胞肺癌細胞株A549和/或乳腺癌細胞株MCF-7。
[0035] 本發(fā)明有益的技術效果在于，本發(fā)明二萜類化合物對結腸癌細胞（HT-29、HCT_8)、 肝癌細胞（Bcl-7402)、非小細胞肺癌（A549)和/或乳腺癌（MCF-7)具有很強的抑制作用， 其中對結腸癌細胞（HT-29、HCT-8)、肝癌細胞（Bcl-7402)和乳腺癌（MCF-7)的抑制作用強 于陽性藥對照；另一方面，化合物I對正常細胞（人臍靜脈內皮細胞VEC)的抑制作用要弱 于陽性藥，表明本發(fā)明化合物I具有抗