濾除菌，轉(zhuǎn)接 種子液時(shí)分別補(bǔ)加上述單獨(dú)除菌的葡萄糖、CaCKMgSO4 · 7H20及抗生素。
[0028] 本發(fā)明有益效果：
[0029] 1)通過(guò)過(guò)表達(dá)內(nèi)源蛋白，可以提高大腸桿菌在3HP脅迫下的存活率。
[0030] 2)通過(guò)本方法，大腸桿菌對(duì)3HP的耐受性明顯提高，提高幅度可以達(dá)到111%，這 對(duì)生物法生產(chǎn)3HP意義重大。
[0031] 縮寫(xiě)和定義
[0032] 3-羥基丙酸：3HP
[0033] 2 維電泳：2D
[0034] AR :酸抗性系統(tǒng)
[0035] 醛脫氫酶A及編碼基因：AldA，aldA
[0036] 蛋白水解亞單位及編碼基因：ClpP，clpP
[0037] 琥珀酰轉(zhuǎn)移酶及編碼基因：DapD，dapD
[0038] 伴侶蛋白及編碼基因：HscA，hscA
[0039] 寡肽透過(guò)酶及編碼基因：OppA，oppA
[0040] 羥基丁酮磷酸合酶及編碼基因：RibB，ribB
[0041] 超氧化物歧化酶及編碼基因：SodB，sodB
[0042] 單鏈DNA結(jié)合蛋白及編碼基因：SSB，ssb
[0043] 氨芐青霉素 ：Amp
[0044] "過(guò)量表達(dá)"或"過(guò)表達(dá)"指細(xì)胞內(nèi)特定基因受到各種信號(hào)調(diào)控后，在生物體中超過(guò) 原有水平表達(dá)，可以通過(guò)增強(qiáng)內(nèi)源表達(dá)或引入外源基因來(lái)實(shí)現(xiàn)。
[0045] "存活率"，酸脅迫單位體積的細(xì)胞數(shù)占非酸脅迫單位體積細(xì)胞數(shù)的比重。
[0046] "酸脅迫"，細(xì)胞生長(zhǎng)的環(huán)境中由于酸過(guò)多引起pH的降低，對(duì)細(xì)胞是一種不利的生 長(zhǎng)環(huán)境。
【附圖說(shuō)明】
[0047] 圖1為本發(fā)明的技術(shù)流程圖。
【具體實(shí)施方式】
[0048] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明不受實(shí)施例的限制。
[0049] 以下實(shí)施例中所用材料、試劑、儀器和方法，未經(jīng)特殊說(shuō)明，均為本領(lǐng)域中的常規(guī) 材料、試劑、儀器和方法，均可通過(guò)商業(yè)渠道獲得。
[0050] 所用酶試劑購(gòu)自MBI Fermentas公司，提取質(zhì)粒所用的試劑盒和回收DNA片段所 用的試劑盒購(gòu)自美國(guó)OMEGA公司，相對(duì)應(yīng)的操作步驟按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行；所有培養(yǎng)基如 無(wú)特別說(shuō)明均用去離子水配制。
[0051] 實(shí)施例1
[0052] 通過(guò)大腸桿菌體內(nèi)過(guò)表達(dá) AldA，ClpP，DapD，HscA，OppA，RibB，SodB，SSB 實(shí)現(xiàn)其 在3HP脅迫下的存活率（技術(shù)流程見(jiàn)圖I)。
[0053] I. 1)抗酸性的蛋白
[0054] 通過(guò)在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá) AldA，ClpP，DapD，HscA，OppA，RibB，SodB，SSB，可 以提高其對(duì)3HP的耐受性。
[0055] 1. 2)單基因表達(dá)載體的構(gòu)建（以PTrcHis2B-aldA為例）
[0056] 以E.coli BL21(DE3)為模板，869和870為引物，通過(guò)PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）擴(kuò) 增醛脫氫酶A基因（aldA)，用膠回收試劑盒回收目的片段，然后用Nc 〇I、Ec〇RI分別酶切基 因和載體pTrcHis2B，酶切產(chǎn)物回收后，將載體和基因按摩爾比1:1的比例混合，加入T4DNA 連接酶后在16°C下連接6-12小時(shí)，連接產(chǎn)物42°C下熱激轉(zhuǎn)化E. coli DH5 α感受態(tài)細(xì)胞， 涂布氨芐青霉素抗性平板培養(yǎng)，PCR篩選陽(yáng)性克?。魂?yáng)性克隆培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切和 測(cè)序鑒定。
[0057] 需要構(gòu)建的其它表達(dá)載體：pTrcHis2B_clpP，pTrcHis2B_dapD，pTrcHis2B_hscA， pTrcHis2B_oppA，pTrcHis2B-ribB，pTrcHis2B_sodB，pTrcHis2B_ssb。構(gòu)建方法同上，引物 分別用：873,874 ;844,845 ;846,847 ;848,849 ;850,851 ;852,853 ;854,855。
[0058] 引物序列和酶切位點(diǎn)見(jiàn)表1。
[0059] 表1實(shí)施例1-3用到的所有引物及其酶切位點(diǎn)
[0060]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種3-羥基丙酸耐受性提高的大腸桿菌，其特征在于，過(guò)表達(dá)以下任一一種或幾種 蛋白：醛脫氫酶A、ATP依賴的蛋白水解亞單位、琥珀酰轉(zhuǎn)移酶、伴侶蛋白、寡肽透過(guò)酶、羥基 丁酮磷酸合酶、超氧化物歧化酶或單鏈DNA結(jié)合蛋白。
2. 權(quán)利要求1所述大腸桿菌，其特征在于，所述過(guò)表達(dá)，是將編碼醛脫氫酶A基因、ATP 依賴的蛋白水解亞單位基因、琥珀酰轉(zhuǎn)移酶基因、伴侶蛋白基因、寡肽透過(guò)酶基因、羥基丁 酮磷酸合酶基因、超氧化物歧化酶基因或單鏈DNA結(jié)合蛋白基因中一種或幾種轉(zhuǎn)入到宿主 菌中通過(guò)IPTG誘導(dǎo)實(shí)現(xiàn)過(guò)表達(dá)。
3. 權(quán)利要求2所述大腸桿菌，其特征在于，所述醛脫氫酶A基因，是醛脫氫酶A基因 aldA;所述ATP依賴的蛋白水解亞單位基因，是ATP依賴的蛋白水解亞單位基因clpP;所述 琥珀酰轉(zhuǎn)移酶基因，是琥珀酰轉(zhuǎn)移酶基因dapD;所述伴侶蛋白基因，是伴侶蛋白基因hscA; 所述寡肽透過(guò)酶基因，是寡肽透過(guò)酶基因oppA;所述羥基丁酮磷酸合酶基因，是羥基丁酮 磷酸合酶基因ribB;所述超氧化物歧化酶基因，是超氧化物歧化酶基因sodB;所述單鏈DNA 結(jié)合蛋白基因，是單鏈DNA結(jié)合蛋白基因ssb。
4. 權(quán)利要求3所述大腸桿菌，其特征在于，所述所有基因，均來(lái)源于E.coli BL21(DE3) 〇
5. 權(quán)利要求1所述大腸桿菌，其特征在于，所述醛脫氫酶A，NCBI的蛋白編號(hào)為 EHY09191 ;所述ATP依賴的ATP依賴的蛋白水解亞單位，NCBI的蛋白編號(hào)為EHY12102 ;所述 琥珀酰轉(zhuǎn)移酶，NCBI的蛋白編號(hào)為EHY12268 ;所述伴侶蛋白，NCBI的蛋白編號(hào)為EHY07424 ; 所述寡肽透過(guò)酶，NCBI的蛋白編號(hào)為EHY09046 ;所述羥基丁酮磷酸合酶，NCBI的蛋白編號(hào) 為EHY05769 ;所述超氧化物歧化酶，NCBI的蛋白編號(hào)為EHY07747 ;所述單鏈DNA結(jié)合蛋白， NCBI的蛋白編號(hào)為EHY07615。
6. -種權(quán)利要求1所述大腸桿菌的構(gòu)建方法，其特征在于，以大腸桿菌BL21 (DE3)的基 因組為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增醛脫氫酶A基因aldA、ATP依賴的蛋白水解亞單位基因clpP、琥 珀酰轉(zhuǎn)移酶基因dapD、伴侶蛋白基因hscA、寡肽透過(guò)酶基因oppA、羥基丁酮磷酸合酶基因 ribB、超氧化物歧化酶基因sodB、單鏈DNA結(jié)合蛋白基因ssb中任--種或幾種基因，擴(kuò)增 結(jié)束后回收目的片段，利用目的片段分別構(gòu)建表達(dá)載體，再將構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到宿 主細(xì)胞中，獲得重組菌，培養(yǎng)并利用IPTG誘導(dǎo)重組菌過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)入基因編碼的蛋白。
7. 權(quán)利要求6所述方法，其特征在于，步驟如下： 1) 以大腸桿菌BL21(DE3)的基因組為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增目的基因，擴(kuò)增結(jié)束后獲得擴(kuò) 增產(chǎn)物； 所述目的基因?yàn)槿┟摎涿窤基因aldA、ATP依賴的蛋白水解亞單位基因clpP、琥珀酰 轉(zhuǎn)移酶基因dapD、伴侶蛋白基因hscA、寡肽透過(guò)酶基因oppA、羥基丁酮磷酸合酶基因ribB、 超氧化物歧化酶基因sodB、單鏈DNA結(jié)合蛋白基因ssb中任一一種或幾種基因； 2) 回收步驟1)所述擴(kuò)增產(chǎn)物中的目的片段，分別與質(zhì)粒載體PTrcHis2B構(gòu)建表達(dá)載 體； 3) 將步驟2)所得的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中，獲得重組菌； 4) 培養(yǎng)步驟3)所得重組菌，并利用IPTG誘導(dǎo)重組菌過(guò)表達(dá)目的基因編碼的蛋白。
8. 權(quán)利要求7所述方法，其特征在于，步驟1)所述PCR擴(kuò)增，醛脫氫酶A基因aldA所 用引物的序列如SEQIDNO.I-SEQIDNO. 2 或SEQIDNO. 23-SEQIDNO. 24 所示；ATP依 賴的蛋白水解亞單位基因ClpP所用引物的序列如SEQIDNO. 3-SEQIDNO. 4或SEQID NO. 25-SEQIDNO. 26所示；琥珀酰轉(zhuǎn)移酶基因dapD所用引物的序列如SEQIDNO. 5-SEQ IDNO. 6所示；伴侶蛋白基因hscA所用引物的序列如SEQIDNO. 7-SEQIDNO. 8所示；寡肽 透過(guò)酶基因oppA所用引物的序列如SEQIDNO. 9-SEQIDNO. 10或SEQIDNO. 17-SEQID NO. 18所示；羥基丁酮磷酸合酶基因ribB所用引物的序列如SEQIDNO.Il-SEQIDNO. 12 所示；超氧化物歧化酶基因sodB所用引物的序列如SEQIDNO. 13-SEQIDNO. 14或SEQID NO. 19-SEQIDNO. 20所示；單鏈DNA結(jié)合蛋白基因ssb的引物序列如SEQIDNO. 15-SEQ IDNO. 16 所示或SEQIDNO. 21-SEQIDNO. 22 所示。
9. 權(quán)利要求7所述方法，其特征在于，步驟3)所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌BL21 (DE3)。
10. 權(quán)利要求7所述方法，其特征在于，步驟4)所述培養(yǎng)并利用IPTG誘導(dǎo)重組菌過(guò)表 達(dá)目的基因編碼的蛋白，是將重組菌與M9培養(yǎng)基以1:100的比例接種后，培養(yǎng)至0D_為 0. 5，加入IPTG至終濃度為0. 5mM，37 °C下過(guò)表達(dá)2h。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種3-羥基丙酸耐受性提高的大腸桿菌及其構(gòu)建方法，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提供的大腸桿菌是過(guò)表達(dá)以下任意一種或幾種蛋白：醛脫氫酶A、ATP依賴的蛋白水解亞單位、琥珀酰轉(zhuǎn)移酶、伴侶蛋白、寡肽透過(guò)酶、羥基丁酮磷酸合酶、超氧化物歧化酶或單鏈DNA結(jié)合蛋白。同時(shí)，本發(fā)明還提供了構(gòu)建上述大腸桿菌的方法。本發(fā)明所提供的大腸桿菌通過(guò)表達(dá)內(nèi)源蛋白，可以提高大腸桿菌在3HP脅迫下的存活率。利用本發(fā)明所提供的方法構(gòu)建獲得的大腸桿菌對(duì)3HP的耐受性明顯提高，提高幅度可以達(dá)到111％，這對(duì)生物法生產(chǎn)3HP意義重大。
【IPC分類】C12N15-70, C12N1-21, C12R1-19
【公開(kāi)號(hào)】CN104726389
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510175613
【發(fā)明人】咸漠, 韓雪萍, 趙廣
【申請(qǐng)人】中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過(guò)程研究所
【公開(kāi)日】2015年6月24日
【申請(qǐng)日】2015年4月14日