利用CRISPR/Cas9抑制HIV-1感染原代淋巴細(xì)胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程和抗病毒感染技術(shù)，尤其涉及一種利用CRISPR/Cas9抑制 HIV-1感染原代淋巴細(xì)胞的方法。具體地說，本發(fā)明利用表達(dá)CRISPR/Cas9核酸酶系統(tǒng)的 Ad5F35型重組腺病毒，靶向編輯人原代⑶4+T淋巴細(xì)胞表面的HIV-1輔助受體CCR5,破壞 CCR5表達(dá)框或使CCR5喪失受體功能，從而抑制HIV-1病毒感染。
【背景技術(shù)】
[0002] 自1984年首次報(bào)道艾滋病毒（HIV-1)為引起艾滋?。ˋIDS)的病原以來，全世界 大批頂尖的科學(xué)家都致力于攻克這一疫病，雖取得了諸多重要進(jìn)展，如通過宣傳教育及聯(lián) 合用藥療法等途徑，顯著改善了 HIV-1感染者的生存質(zhì)量，以及使新發(fā)HIV-1感染人數(shù)大幅 下降；但目前仍缺乏有效的疫苗和可治愈HIV-1感染的療法。人們迫切需要新的更高效的 替代方法，應(yīng)對HIV-1疫情。近年來新興的基因治療技術(shù)，具有對抗HIV-1、乃至清除病毒感 染的潛能。
[0003] 基因治療（gene therapy)又稱為基因療法，是指采用基因工程技術(shù)，在核酸水平 糾正患者的致病基因，或者改造疾病發(fā)生所必需的編碼基因，從而使患者獲得抗病能力或 治愈疾病的方法[Nat Bi0teChn0l，2007,25(12) :1444-54]。通常采用復(fù)制缺陷型病毒載 體，將編碼正常功能的基因或靶向致病基因的干擾RNA投遞至患者細(xì)胞。在HI V-1基因治療 領(lǐng)域，最具應(yīng)用潛能的策略之一當(dāng)屬以趨化因子受體CCR5為靶標(biāo)的基因編輯技術(shù)[N Engl J Med，2014,370(10) :901-10;Nat Biotechnol，2008,26(7) :808-16]，因?yàn)?CCR5 是 R5 嗜 性的HIV-1病毒（早期感染階段多見）入侵必需的輔助受體，阻斷該受體即能阻斷病毒入 侵。而CCR5的缺失，不會(huì)影響人的正常生理功能，正常人中有部分群體遺傳性缺失CCR5基 因中一段 32bp 堿基（CCR5A32)[Cell，1996,86(3) :367-77]，先天對 HIV-1 不敏感。
[0004] 基因編輯技術(shù)是基因治療的主要手段之一，利用被稱為"分子剪刀"的核酸酶，對 基因組特定位點(diǎn)進(jìn)行插入、置換或剪切等改造，以實(shí)現(xiàn)疾病防治的功能?；蚓庉嫷倪^程 分為三步：首先，特異設(shè)計(jì)的導(dǎo)向序列ONA結(jié)合元件）與目的DNA序列結(jié)合；然后，在導(dǎo) 向序列引導(dǎo)下，核酸內(nèi)切酶（DNA切割元件）對待編輯位點(diǎn)進(jìn)行切割，在兩條DNA鏈上各形 成一個(gè)切口；最后，雙切口激活胞內(nèi)固有的修復(fù)機(jī)制，通常為錯(cuò)誤傾向的非同源末端接合機(jī) 制（NHEJ)，修復(fù)切口的同時(shí)，在切口附近引起缺失、插入，有外源同源片段存在時(shí)，還可引發(fā) 同源重組機(jī)制，導(dǎo)致鏈置換和大片段插入。常見的核酸酶系統(tǒng)主要有鋅指核酸酶（ZFN)、類 轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（TALEN)和常間斷短回文重復(fù)序列聚族關(guān)聯(lián)蛋白核酸酶系統(tǒng) (CRISPR/Cas9) [Trends in Biotechnol，2013, 31 (7) :397-405]，它們被稱為基因編輯技術(shù) 領(lǐng)域里的三大利器。
[0005] CRISPR/Cas9是一種來源于原核生物的新型核酸酶系統(tǒng)，它由導(dǎo)向序列sgRNA和 核酸酶Cas9兩種元件組成。sgRNA可識(shí)別基因組中核甘酸序列為5'-NGG-3'的前間區(qū)序 列鄰近基序（PAM motif),依據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則與祀向序列結(jié)合，Cas9在sgRNA的導(dǎo)向 下，特異性切割靶向序列，導(dǎo)致序列變化。與ZFN、TALEN相比，CRISPR/Cas9系統(tǒng)具有操控性 強(qiáng)、特異性高、用途廣泛等優(yōu)點(diǎn)。采用針對HIV-1LTR啟動(dòng)子的CRISPR/Cas9系統(tǒng)，可特異性 切割LTR，在細(xì)胞系水平清除潛伏感染的HIV-1基因組[Proc Natl Acad Sci U S A，2014， 111(31) :11461-6 ;Sci R印，2013, 3:2510]。應(yīng)用 RNA 導(dǎo)向的 Cas9 編輯 CCR5 的研究，也在 細(xì)胞系水平取得了一些前期結(jié)果，編輯效率甚至比TALEN更高[Proc Natl Acad SciU S A， 2014, 111 (26) :9591-6]。在體內(nèi)HIV-1主要感染⑶4+T淋巴細(xì)胞，由于原代T細(xì)胞通常難 以被轉(zhuǎn)導(dǎo)，且Cas9蛋白的編碼基因較大，常規(guī)方法很難將其表達(dá)在淋巴細(xì)胞中，目前尚沒 有應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)，在原代T淋巴細(xì)胞水平開展針對CCR5的基因編輯研究。
[0006] CRISPR/Cas9元件較大，全長4. 2kb，加上啟動(dòng)子等組分后超過5kb，利用即有的 慢病毒載體，病毒滴度低，難以滿足慢分裂或不分裂細(xì)胞，如原代細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)需要。腺病毒載 體是一種復(fù)制缺陷型的載體，已被證實(shí)可用于基因治療、疫苗載體及基礎(chǔ)生物學(xué)研究，它具 有包裝容量大、滴度高、可感染細(xì)胞類型多、免疫原性弱、致癌風(fēng)險(xiǎn)低等特點(diǎn)[Nat Protoc， 2007,2(5) :1236-47]。但是，常規(guī)的Ad5型腺病毒，難以轉(zhuǎn)導(dǎo)包括⑶4+T細(xì)胞在內(nèi)的造血系 細(xì)胞。
[0007] 為了克服這一挑戰(zhàn)，本發(fā)明首次利用Ad5F35嵌合型腺病毒載體，表達(dá)CRISPR/ Cas9系統(tǒng)，這即結(jié)合了 CRISPR/Cas9系統(tǒng)與腺病毒載體的上述優(yōu)勢，又利用了 Ad5F35嵌合 型腺病毒對CD4+T細(xì)胞的強(qiáng)感染嗜性。本發(fā)明在T淋巴細(xì)胞基因編輯領(lǐng)域及HIV-1基因治 療領(lǐng)域均具有重要的應(yīng)用潛能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是提供一種利用CRISPR/Cas9抑制HIV-1感染原代淋巴細(xì)胞的方 法。
[0009] 本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的：
[0010] 采用最新開發(fā)出來的CRISPR/Cas9核酸酶系統(tǒng)，篩選得到可高效、特異性地編輯 HIV-1入侵所必需的輔助受體CCR5表達(dá)的sgRNA，結(jié)合使用強(qiáng)淋巴細(xì)胞嗜性的Ad5F35嵌合 型腺病毒載體，將CRISPR/Cas9系統(tǒng)投遞至人原代⑶4+T淋巴細(xì)胞中，敲除CCR5表達(dá)，從而 抑制HIV-1病毒入侵和感染。
[0011] 所述CRISPR/Cas9核酸酶系統(tǒng)是指來源于化膿性鏈球菌（Streptococcus pyogenes)的一種II型CRISPR/Cas系統(tǒng)，因II型特異地使用Cas9核酸酶，故被稱為 CRISPR/Cas9系統(tǒng)。2013年，首次報(bào)道細(xì)菌的II型CRISPR/Cas9系統(tǒng)可應(yīng)用于哺乳動(dòng)物 細(xì)胞的基因組編輯研究[Science，2013,339(6121) :819-23;Science，2013,339(6121): 823-6]。最初報(bào)道認(rèn)為CRISPR/Cas9在體外發(fā)揮作用需四個(gè)組分：Cas9核酸酶、III型核 糖核酸酶（RNAse III)以及兩種crRNA :反式激活crRNA(tracrRNA)和一種crRNA前體 (pre-crRNA)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，RNAse III為非必需組分，而pre-crRNA成熟體可與部分 tracrRNA嵌合，構(gòu)成一個(gè)導(dǎo)向序列sgRNA，因而，CRISPR/Cas9系統(tǒng)發(fā)揮作用僅需兩個(gè)必需 組分：Cas9核酸酶和sgRNA序列。
[0012] 所述CCR5是一種趨化因子受體，是R5嗜性（在早期感染中多見）的HIV-1病毒入 侵靶細(xì)胞（主要為CD4+T淋巴細(xì)胞）所必需的輔助受體，敲除該受體的表達(dá)，可抑制HIV-1 病毒的入侵和感染，CCR5開放閱讀框（0RF)的全長核甘酸序列如SEQ ID N0:4所示。因在 正常人群中存在該受體的遺傳性突變體CCR5A32, CCR5是HIV-1藥物和基因治療研究中極 具潛能的靶點(diǎn)。
[0013] 所述Ad5F35嵌合型腺病毒載體是在常規(guī)Ad5型腺病毒載體的基礎(chǔ)上，改造了受 體結(jié)合的纖突區(qū)的嵌合型載體。腺病毒包括7個(gè)種（A-G)，57個(gè)血清型，常用的腺病毒載 體來源于2型和5型腺病毒，其中以5型（Ad5)最常見。Ad5以柯薩奇病毒-腺病毒受體 (coxsackievirus and adenovirus receptor，CAR)為入侵受體，通過病毒表達(dá)的纖突蛋白 與CAR相互作用入侵靶細(xì)胞[J Virol，2005, 79(19) :12125-31]。CAR廣泛表達(dá)于多種組織 和細(xì)胞，因此Ad5具有較廣譜的嗜性。但是造血干細(xì)胞來源的細(xì)胞，如作為HIV-1主要靶細(xì) 胞的T淋巴細(xì)胞，很少表達(dá)CAR,難以被Ad5感染。而B種腺病毒，不同于其它6種腺病毒， 以CD46為受體[Nat Med，2003,9(ll) :1408-12]，CD46分布在包括造血系細(xì)胞在內(nèi)的諸多 細(xì)胞類型表面。研究表明，含有嵌合F5/F35纖突的Ad5,對造血系細(xì)胞的嗜性顯著增加。
[0014] 所述的攜帶CRISPR/Cas9核酸酶系統(tǒng)的Ad5F35嵌合型腺病毒載體，不限于用于編 輯CCR5,還可以用于靶向編輯T淋巴細(xì)胞的其它基因，以及其它難以被Ad5型腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)， 但易于被Ad5F35嵌合型腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的造血系細(xì)胞，如造血干細(xì)胞所表達(dá)的基因。用于編輯 其它基因時(shí)，只需使用特異性靶向該基因的sgRNA序列即可。
[0015] 具體地說，本發(fā)明的技術(shù)方案是：
[0016] 一、設(shè)計(jì)一種表達(dá)CRISPR/Cas9系統(tǒng)且可靶向CCR5的Ad5F35型腺病毒載體，該載 體：
[0017] ①表達(dá)Cas9核酸酶；
[0018] ②表達(dá)靶向HIV-1輔助受體CCR