催化酯化和酯交換的Sn-1,3選擇性固定化脂肪酶及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于食品和酶工程領(lǐng)域。更具體而言，本發(fā)明涉及針對兼具酯化、酯交換催 化功能的Sn-1，3選擇性脂肪酶的固定化方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 脂肪酶（lipase，EC3. 1. 1. 3)全稱為甘油三酰酯水解酶，它能夠特異性地在油水 界面上發(fā)揮催化活性，在食品、造紙、皮革、洗滌劑、制藥等工業(yè)上有著巨大的應(yīng)用。不同菌 種來源的脂肪酶除了催化油脂水解以外，還可以具有催化酯化、酯交換、醇解、消旋體拆分 等功能。然而，天然脂肪酶穩(wěn)定性差、反應(yīng)后難以純化、不能重復(fù)利用，這不僅降低了酶的 使用效率，提高了生產(chǎn)成本，而且難以實現(xiàn)連續(xù)化操作，限制了其在工業(yè)上的應(yīng)用。通過固 定化技術(shù)將酶賦形于具有一定機械強度的載體之上，成為解決上述生產(chǎn)瓶頸的一種有效途 徑。
[0003] 固定化酶技術(shù)是將游離的酶通過物理或者化學(xué)手段將其束縛或限制于一定區(qū)域 內(nèi)，使其仍然能進行特有的催化反應(yīng)并能回收重復(fù)使用的一種技術(shù)。由于上述優(yōu)點，使得很 多科研工作者展開了對固定化酶的細(xì)致研究。在1967年，固定化酶首次被應(yīng)用在拆分氨基 酸工業(yè)中。近年來隨著有機化學(xué)、蛋白質(zhì)化學(xué)、材料科學(xué)等的發(fā)展，固定化酶技術(shù)取得了長 足的進步。
[0004] 在油脂領(lǐng)域里應(yīng)用最廣的固定化脂肪酶分別為：高酯交換能力Sn-1，3專一性強 的固定化脂肪酶；以及用于制備脂肪酸酯的高酯化活力的固定化脂肪酶。通常選擇固定 化具備高酯交換活力及Sn-1，3位特異性的脂肪酶，其可選自（但不限于）：疏棉狀嗜熱 絲抱菌（Thermomyceslanuginose)、米黑根毛霉（Rhizomucormiehei)、米黑毛霉（Mucor miehei)、假單胞菌（Pseudomonassp.)/根霉（Rhizopussp.)、黑曲霉（Aspergillus niguer)及伯克霍爾德氏（Burkholderiasp.)。而對于短鏈脂肪酸酯合成方面的應(yīng)用，貝lj選 擇諸如（但不限于）：南極假絲酵母B(CandidaAntarcticaB)/南極假絲酵母A(Candida AntarcticaA)、皺裙假絲酵母（Candidarugosa)等。
[0005]CarlaTecelSo等人（"Productionofhumanmilkfatsubstitutesenriched inomega-3polyunsaturatedfattyacidsusingimmobilizedcommerciallipasesand Candidaparapsilosis1ipase/acyltransferasey,,JournalofMolecularCatalysis B:EnZymatic，65(2010) 122-127)研究了以富含棕櫚酸的甘三酯和油酸為反應(yīng)底物，以 LipozymeTLIM(由諾維信（Novozyme)股份公司出品的一種固定化脂肪酶）、LipozymeRM IM、Novozyme435(這三種酶均為諾維信（Novozyme)股份公司出品的固定化脂肪酶）為催化 劑制備0P0(1，3-二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯）。研究發(fā)現(xiàn)：在2位插入率方面，反應(yīng)第一 批時Novozyme435表現(xiàn)出較差的專一性，在Sn-2位上插入了較多的油酸（33. 2%摩爾比）， 證明其在酸解的時候沒有專一性。并且，研究中還發(fā)現(xiàn)在反應(yīng)一批之后，除了LipozymeRM IM反應(yīng)10批能仍保持較好活力之外，另外兩種酶的剩余酶活隨著反應(yīng)次數(shù)的增加都下降 得很快，LipozymeTLM在反應(yīng)10批后剩余的活力僅為20%左右。
[0006]IgorNascentesdosSantosCorrea等人（"EnzymaticBiodieselSynthesis UsingaByproductObtainedfromPalmOilRefining"，EnzymeResearch, 2011,文章 ID:814507)研究了 以棕櫚油脂肪酸脫臭饋出物（PFAD,palmoilfattyaciddistillate) 和短鏈醇為反應(yīng)底物，以LipozymeTLM、Lip〇ZymeRM頂為催化劑來制備脂肪酸的單 烷基酯。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：以甲醇為?；w時，LipozymeRMIM催化生成甲酯的轉(zhuǎn)化率 為52.3%，1^口(《71116 11]催化生成甲酯的轉(zhuǎn)化率為28.8%，證明了1^口〇271116 11]和 LipozymeRMIM不適合催化酯化反應(yīng)。
[0007]Hernandez-MartInE等（"Differentenzymerequirementsforthe synthesisiofbiodieselNovozyme435andLipozymeTLIM，',BioresourceTechnology, 99(2008)277-286)揭示了以甘三酯為底物、10%W/W的酶添加量反應(yīng)24h，LipozymeTL頂 反應(yīng)一次以后第二次僅剩10%的酶活。這說明LipozymeTL頂在重復(fù)使用性上存在很大 局限。
[0008]MohamedM.Soumanou等(Improvementinlipase-catalyzedsynthesisof fattyacidmethylestersfromsunfloweroil,enzymeandMicrobialTechnology, 33 (2003) 97-103)揭示了以葵花籽油為底物，分批添加甲醇，反應(yīng)24h，LipozymeTL頂經(jīng) 過8批反應(yīng)后活力僅剩下不到30%。該研究結(jié)果進一步驗證了Herndndez-MartinE等人的 觀點。
[0009]目前很多固定化脂肪酶的方法都是以高分子樹脂為載體，通過一定的技術(shù)手段將 脂肪酶負(fù)載于樹脂之上。例如，專利公告號為EP0140542B1的專利中描述了一種關(guān)于將米 黑根毛霉產(chǎn)脂肪酶固定于大孔弱堿性陰離子交換樹脂上，并將其用于酯交換或者酸解反 應(yīng)。謝志東等（"聚丙烯酸甲酯類大孔樹脂對豬胰脂肪酶的固定化研究"，離子交換與吸附， 1995,11 (1)，24~29)以自己合成的大孔丙烯酸甲酯-二乙烯苯交聯(lián)共聚物為載體對豬胰 脂肪酶進行了固定化，并對其水解活力進行了考察。
[0010] 雖然現(xiàn)有技術(shù)中對脂肪酶的固定化有一定的研究，但現(xiàn)在面臨的最大挑戰(zhàn)是：到 目前為止還沒有一種固定化酶可同時催化酯交換及酯化反應(yīng)，并且還具有較強的專一性， 這就限制了固定化酶在油脂加工業(yè)，如生物柴油、功能性油脂、精細(xì)化工品中的應(yīng)用。
[0011] 因此，本領(lǐng)域中迫切需要開發(fā)出可同時催化酯交換及酯化反應(yīng)、且還具有較強的 專一性的固定化酶及其制備方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 本發(fā)明的主要目的就在于提供可同時催化酯交換及酯化反應(yīng)、且還具有較強的專 一性（如Sn-1選擇性）的固定化酶及其制備方法。本發(fā)明的另一目的在于提供本發(fā)明的 固定化酶在催化酯交換、酯化、酸解和/或醇解反應(yīng)中的應(yīng)用，以及采用本發(fā)明的固定化酶 催化這些反應(yīng)的方法。本發(fā)明中還提供了包含本發(fā)明固定化脂肪酶的試劑盒或產(chǎn)品。此 外，本發(fā)明的另一目的還在于提供堿性離子交換樹脂載體在制備本發(fā)明固定化脂肪酶中的 應(yīng)用。
[0013] 在本發(fā)明的第一方面中，提供了一種固定化脂肪酶，其包含：
[0014] (a)載體，其中所述載體的功能基團是與C8_15的烷烴末端連接的伯胺基，所述功能 基團含量為〇? 5~6mmol/g，孔徑分布為12~80nm;
[0015] (b)固定于所述載體的脂肪酶。
[0016] 在一些實例中，所述載體的功能基團含量為1~5mmol/g，孔徑分布為15~60nm, 優(yōu)選的，所述載體的粒徑分布為〇. 1~〇. 4mm，優(yōu)選為0. 15~0. 3mm，比表面積為100~ 600m2/g，優(yōu)選為 150 ~500m2/g。
[0017] 在一些實例中，所述載體是堿性離子交換樹脂載體，優(yōu)選弱堿性離子交換樹脂載 體。
[0018] 在本發(fā)明的一些實例中，所述載體的骨架為聚丙烯酸酯型或苯乙烯型骨架。
[0019] 在另一些實例中，所述載體為弱堿性丙烯酸離子交換樹脂或弱堿性聚苯乙烯離子 交換樹脂。
[0020] 在另一些實例中，所述載體由選自下組的材料制成：丙烯酸酯的交聯(lián)聚合物；交 聯(lián)聚甲基丙烯酸甲酯；甲基丙烯酸酯、順丁烯二酸二甲酯、乙酸烯丙酯、丙烯腈或甲基乙烯 基甲酮與苯乙烯或二乙烯苯的共聚物；丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯與雙甲基丙烯酸乙二醇酯 的交聯(lián)共聚物；或苯乙烯與二乙烯苯的共聚物。
[0021] 在另一些實例中，所述載體為丙烯酸甲酯-二乙烯苯共聚物或苯乙烯與二乙烯苯 的共聚物。
[0022] 在一些實例中，所述堿性離子交換樹脂是弱堿性丙烯酸離子交換樹脂，優(yōu)選的，所 述弱堿性丙烯酸離子交換樹脂采用以下方法制備：（i)制備丙烯酸類化合物-二乙烯苯的 共聚物；（ii)溶脹所述共聚物，并對其進行胺化。
[0023] 在另一些實例中，所述堿性離子交換樹脂是由丙烯酸甲酯（或丙烯酸羥乙酯、丙 烯酸環(huán)氧丙酯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸羥乙酯，甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯）與二乙烯苯以 20:1~1:1的質(zhì)量比（優(yōu)選15:1~10:1)，在致孔劑（例如甲苯和液蠟的混合物、或汽油、 正庚烷、乙酸丁酯、1，2_二氯乙烷）與引發(fā)劑（）過氧化苯甲酰、偶氮二異丁氰、或過硫酸 鉀）存在的情況下聚合，其中的共聚物與致孔劑的比例為3:1~1:3 (優(yōu)選3:2~3:4)，引發(fā) 劑為上述體系的〇. 1%(質(zhì)量比）。上述單體的聚合溫度范圍為60~100°C，優(yōu)選65~85°C。 所得共聚物與溶脹劑（N，N-二甲基甲酰胺、硝基苯、二氯甲烷、二氯乙烷、二硫化碳、二氧六 環(huán)或其混合物）以1:1~1:15的體積比（優(yōu)選1:2~1:10)進行溶脹，溶脹條件可為：室 溫下，共聚物在溶脹劑中浸泡，溶脹4~24小時，優(yōu)選6~16小時。將共聚物與1，8_辛二 胺以共聚物中甲酯鍵與1，8-辛二胺的摩爾比以1:1~1:10(優(yōu)選1:2~1:5)的比例，在 100~150°C(優(yōu)選120~140°C)下胺化，胺化反應(yīng)時間為4~24小時（優(yōu)選8~12小 時）。
[0024] 在一些實例中，所述堿性離子交換樹脂是弱堿性聚苯乙烯離子交換樹脂，優(yōu)選的， 所述弱堿性聚苯乙烯離子交換樹脂采用下述方法制備：（i'）制備聚苯乙烯微球；（ii'）溶 脹所述微球，并對其進行氯酰化；（iii'）溶脹所述氯酰化樹脂微球，并對其進行胺化。
[0025] 在一些實例中，所述堿性離子交換樹脂是由苯乙烯、二乙烯苯和致孔劑（如，甲苯 和液蠟的混合物、或汽油、正庚烷、乙酸丁酯、1，2-二氯乙烷，優(yōu)選甲苯和液蠟2:1體積比的 混合物）在引發(fā)劑（如過氧化苯甲酰、偶氮二異丁氰、過硫酸鉀，優(yōu)選過氧化苯甲酰）的存 在下制備聚苯乙烯微球。其中，苯乙烯與二乙烯苯的質(zhì)量比為5:1~1:2,優(yōu)選3:1~1:1 ; 苯乙烯和二乙烯苯與致孔劑的質(zhì)量比為1:1~1:6,優(yōu)選1:1. 5~1:4。上述單體的聚合溫 度范圍為60~95°C，優(yōu)選80~90°C。聚合時間范圍為4~10小時，優(yōu)選6~8小時。所 得聚苯乙烯的微球在1:1~1:15體積比，優(yōu)選1:2~1:10的溶脹劑（優(yōu)選但不限于二氯 甲烷、N，N-二甲基甲酰胺、硝基苯、二氯甲烷、二氯乙烷、二硫化碳、二氧六環(huán)或其混合物） 中溶脹。溶脹條件為：室溫下，共聚物在溶劑中浸泡，溶脹4~24小時，優(yōu)選6~16小時。 上述微球中的亞芐基與9-氯壬酰氯的摩爾比為1:0. 1~1:2,優(yōu)選1:0. 2~1:1，9_氯壬 酰氯與催化劑（無水氯化鋅、無水氯化錫，優(yōu)選無水氯化鋁）的摩爾比為1:0. 1~1:2,優(yōu) 選1:0.2~1:1，在30~751：(優(yōu)選35~50°〇下進行氯酰化，反應(yīng)時間2~1211，優(yōu) 選3~8h。將所得的氯酰化樹脂微球在1:1~1:15體積比（優(yōu)選1:2~1:10)的溶脹劑 (N，N-二甲基甲酰胺、硝基苯、二氯甲烷、二氯乙烷、二硫化碳、二氧六環(huán)或其混合物）存在 下溶脹4~10小時，優(yōu)選6~8小時。與