一種豬瘟mPCR檢測試劑盒及其使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種豬瘟mPCR檢測試劑盒及其使用方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬癌（ClassicalSwineFever，CSF)是由豬癌病毒（ClassicalSwineFever Virus，CSFV)引起豬的一種急性、熱性和高度接觸傳染的病毒性傳染病，對養(yǎng)豬業(yè)危害十分 嚴重，被國際獸疫局（0IE)列為16種A類法定傳染病之一，也是我國法定的一類動物疫病。 CSFVRNA基因組全長12. 3kb，含有單一的開放閱讀框（0RF)，可順次翻譯衣殼蛋白C和囊膜 糖蛋白E1、E2、E3等4種結(jié)構(gòu)蛋白以及3~5種非結(jié)構(gòu)蛋白。其中，E2(gp55)是最具免疫活 性的囊膜糖蛋白，可誘導動物產(chǎn)生有效的免疫保護。豬瘟弱毒疫苗在中國的大規(guī)模應(yīng)用，使 豬瘟野毒感染和疫苗接種的區(qū)分變得非常困難但又十分必要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是：提供一種豬瘟mPCR檢測試劑盒及其使用方法，能快 捷有效地區(qū)分弱毒免疫豬和野毒感染豬。
[0004] 本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種豬瘟mPCR檢測試劑盒，包含Parti和Part2,Parti: 2X1StepBuffer12. 5-25 微升，RNaseFreeH207. 5-15 微升，PrimeScriptOneStep EnzymeMix1-2 微升，陽性對照；Part2:SolutionA200-400 微升，SolutionB75-150 微 升，RinseA500-1000 微升，RinseB800-1600 微升，ElutionBuffer50-10 微升，Spin Column1支以上，CollectionTube2支以上，薄壁PCR管1支，上樣緩沖液1-2微升。
[0005] Parti零下2(TC保存，Part2室溫保存。
[0006] -種豬瘟mPCR檢測試劑盒的使用方法，包含以下步驟： (1) 取病料樣本，加入尚心管中；后加入SolutionA，振湯混勾后，室溫放直； (2) 加入SolutionB，混合均勻后，室溫放置，后離心；將上清液轉(zhuǎn)移到l#Collection Tube中，加異丙醇和冰乙酸混勻； (3) 將Spin Column安置于2#Collection Tube上；將步驟（2)的上清液轉(zhuǎn)移至Spin Column中，離心，棄濾液； (4) 將RinseA加入至上述SpinColumn中，室溫靜置，離心，棄濾液； (5) 將RinseB加入至SpinColumn中，離心，棄濾液；再次離心； (6) 將SpinColumn安置于離心管上，在SpinColumn膜的中央處加入滅菌蒸饋水或 ElutionBuffer，室溫靜置；離心，洗脫病毒RNA/DNA，得到病料模板； (7) mPCR擴增：2X1StepBuffer、PrimeScriptOneStepEnzymeMix、CSFV野毒 上下游引物、CSFV疫苗毒上下游引物、上述病料模板和RNaseFreeH20進行PCR擴增反應(yīng)； (8) 取PCR產(chǎn)物及陽性對照分別與上樣緩沖液混合均勻后，于1XTAE瓊脂糖凝膠中電 泳檢測，紫外燈下觀察結(jié)果，即可。
[0007] 首次使用前，在RinseA中添加12. 5mL的100%乙醇；在RinseB中添加31. 5mL 的100%乙醇。
[0008] CSFV野毒上下游引物： F2 :5'- AGATTCCAGTGGTGAGAGGGGTA -3' ， R2 :5'_ GCCGGCGCTAAATAAATAAAAAAT -3'，片段 641bp。
[0009] CSFV疫苗毒上下游引物： F1 :5'-AGTAAGTAGCAAGACCGGGAAT-3'， R1 :5' -GGCGATAAATAAAAAAGAAAAAAAAG-3'，片段 278bp。
[0010] 本發(fā)明的有益效果：現(xiàn)有的利用PCR檢測和診斷的方法較多，且只能檢測出存在 豬瘟病毒感染，但不能區(qū)別是否為接種豬瘟病毒弱毒免疫和自然野毒所引起的感染；該二 重PCR方法可一步同時區(qū)分豬瘟病毒弱毒免疫豬和野毒感染豬的鑒別，為首創(chuàng)。
【附圖說明】
[0011] 圖1為CSFV野毒、疫苗毒和野毒與疫苗毒混合物多重PCR方法檢測結(jié)果；M : DLlOOOmarker ;1 :CSFV野毒株多重PCR產(chǎn)物；2 :疫苗多重PCR產(chǎn)物；3 :野毒株與疫苗毒混 合多重PCR產(chǎn)物； 圖 2 為多重PCR特異性試驗結(jié)果；M. DLlOOOmarker ;1:PRV ;2:PRRSV ;3:SIV ;4:PCV2和 CSFV混合物； 圖 3 為多重 PCR 敏感性試驗結(jié)果；M. DL1000 marker;l:101;2:100;3:10-l;4:10-2; 5:10-3 ；6:10-4 ；7:10-5 ；8:10-6 ； 圖4為多重PCR樣本檢測結(jié)果；M. DL2000 marker;l號樣；2號樣；3號樣；4號樣；5 號樣；6號樣；7號樣；8號樣；9號樣。 具休定掄古式
[0012] 1使用時請置十冰盆上使用。
【主權(quán)項】
1. 一種豬癌mPCR檢測試劑盒，其特征在于：包含Parti和Part2，Parti :2X 1 Step Buffer 12. 5-25 微升，RNase Free H207. 5-15 微升，PrimeScript One Step Enzyme Mix 1-2 微升，陽性對照；Part2:Solution A 200-400 微升，Solution B 75-150 微升，Rinse A 500-1000 微升，Rinse B 800-1600 微升，Elution Buffer 50-10 微升，Spin Column 1 支 以上，Collection Tube 2支以上，薄壁PCR管1支，上樣緩沖液1-2微升。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種豬瘟mPCR檢測試劑盒，其特征在于：Partl零下20°C保 存，Part2室溫保存。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的一種豬瘟mPCR檢測試劑盒的使用方法，其特征在于：包含 以下步驟： (1) 取病料樣本，加入尚心管中；后加入Solution A，振湯混勾后，室溫放直； (2) 加入Solution B，混合均勻后，室溫放置，后離心；將上清液轉(zhuǎn)移到l#Collection Tube中，加異丙醇和冰乙酸混勻； (3) 將Spin Column安置于2#Collection Tube上；將步驟（2)的上清液轉(zhuǎn)移至Spin Column中，離心，棄濾液； (4) 將Rinse A加入至上述Spin Column中，室溫靜置，離心，棄濾液； (5) 將Rinse B加入至Spin Column中，離心，棄濾液；再次離心； (6) 將Spin Column安置于離心管上，在Spin Column膜的中央處加入滅菌蒸饋水或 Elution Buffer，室溫靜置；離心，洗脫病毒RNA/DNA，得到病料模板； (7) mPCR 擴增：2X1 Step Buffer、PrimeScript One Step Enzyme Mix、CSFV 野毒 上下游引物、CSFV疫苗毒上下游引物、上述病料模板和RNase Free H20進行PCR擴增反應(yīng)； (8) 取PCR產(chǎn)物及陽性對照分別與上樣緩沖液混合均勻后，于1 XTAE瓊脂糖凝膠中電 泳檢測，紫外燈下觀察結(jié)果，即可。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種豬瘟mPCR檢測試劑盒的使用方法，其特征在于：首次使 用前，在Rinse A中添加12. 5mL的100%乙醇；在Rinse B中添加31. 5mL的100%乙醇。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種豬瘟mPCR檢測試劑盒的使用方法，其特征在于：CSFV野 毒上下游引物： F2 :5'- AGATTCCAGTGGTGAGAGGGGTA -3' ， R2 :5'_ GCCGGCGCTAAATAAATAAAAAAT -3'，片段 641bp。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種豬瘟mPCR檢測試劑盒的使用方法，其特征在于：CSFV疫 苗毒上下游引物： F1 :5'-AGTAAGTAGCAAGACCGGGAAT-3'， R1 :5' -GGCGATAAATAAAAAAGAAAAAAAAG-3'，片段 278bp。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種豬瘟mPCR檢測試劑盒，其特征在于：包含Part1和Part2，Part1：2×1 Step Buffer 12.5-25微升，RNase Free H2O 7.5-15微升，PrimeScript One Step Enzyme Mix 1-2微升，陽性對照；Part2：Solution A 200-400微升，Solution B 75-150微升，Rinse A 500-1000微升，Rinse B 800-1600微升，Elution Buffer 50-10微升，Spin Column 1支以上，Collection Tube 2支以上，薄壁PCR管1支，上樣緩沖液1-2微升?，F(xiàn)有的利用PCR檢測和診斷的方法較多，且只能檢測出存在豬瘟病毒感染，但不能區(qū)別是否為接種豬瘟病毒弱毒免疫和自然野毒所引起的感染；該二重PCR方法可一步同時區(qū)分豬瘟病毒弱毒免疫豬和野毒感染豬的鑒別，為首創(chuàng)。
【IPC分類】C12R1-93, C12Q1-68, C12Q1-70
【公開號】CN104673939
【申請?zhí)枴緾N201510130746
【發(fā)明人】湯德元, 馬萍, 曾智勇, 李達, 劉霞, 唐宇, 方英
【申請人】貴州大學, 貴州省動物疫病預防控制中心
【公開日】2015年6月3日
【申請日】2015年3月25日