一種藍耳病疫苗抗原純化的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物制品技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及一種藍耳病疫苗抗原純化的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 在我國，藍耳病（豬繁殖與呼吸綜合征?。┮呙绲目乖刹《窘臃N細胞直接培養(yǎng) 得到，沒有后續(xù)的抗原下游處理工藝，該生產(chǎn)工藝生產(chǎn)的抗原雜質(zhì)較多，導(dǎo)致疫苗的免疫副 反應(yīng)大，產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定，影響疫苗免疫效果。近年來也有企業(yè)、學(xué)者在藍耳病疫苗抗原下 游加工處理方面進行了研宄。唐艷玲等在2013年采用分子篩層析柱對藍耳病滅活疫苗抗 原進行純化，蛋白去除率達到96%，病毒回收率在76. 7%~82. 4%之間。該方法可有效的 去除抗原雜蛋白，但填充介質(zhì)需要人工進行，受操作者的因素影響較大，工藝的可重復(fù)性較 差，且該方法成本較高，不適用于當(dāng)前的疫苗生產(chǎn)。
[0003] 藍耳病疫苗抗原通常來自于藍耳病病毒感染細胞后進行細胞培養(yǎng)、獲得的細胞培 養(yǎng)的裂解產(chǎn)物，其中含有大量大小不等的細胞裂解碎片，成分較為復(fù)雜，因此純化藍耳病疫 苗抗原的條件和方法較利用雞胚生產(chǎn)的疫苗抗原的純化方法更為復(fù)雜，需要對其純化方法 進行更進一步的研宄和優(yōu)化，以獲得更高的抗原回收率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為克服上述缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種工序簡單、利于操作、成本低廉的藍耳 病疫苗抗原純化的方法。
[0005] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明利用分子量切割的超濾技術(shù)對藍耳病疫苗抗原進行純 化，該方法包括如下步驟：
[0006] (1)將收獲的藍耳病疫苗抗原經(jīng)離心機離心澄清，收取澄清的抗原液；
[0007] (2)將步驟（1)得到的澄清抗原液泵入超濾系統(tǒng)進行純化；
[0008] (3)用緩沖液將步驟（2)中純化得到的抗原液稀釋至原體積繼續(xù)純化；
[0009] (4)用緩沖液將步驟（3)中純化得到的抗原液稀釋至原體積繼續(xù)純化后，收獲純 化的藍耳病疫苗抗原。
[0010] 本發(fā)明提供的對藍耳病疫苗抗原進行純化的方法中，步驟（1)所述的藍耳病疫苗 抗原為經(jīng)滅活劑滅活后的藍耳病滅活疫苗抗原或藍耳病活疫苗抗原。
[0011] 其中，步驟⑴采用差速離心的方法。
[0012] 所述差速離心為先采用4000-7000rpm離心20-40min，取上清棄沉淀，然后將上清 液以8000-12000rpm離心50_70min，取上清備用。
[0013] 優(yōu)選地，所述差速離心為先采用6000rpm離心30min，取上清棄沉淀，然后將上清 液以lOOOOrpm離心60min，取上清備用。
[0014] 本發(fā)明提供的對藍耳病疫苗抗原進行純化的方法中，步驟（2)中超濾系統(tǒng)為切向 流超濾系統(tǒng)。
[0015] 所述切向流超濾系統(tǒng)為平板式切向流超濾系統(tǒng)。
[0016] 進一步地，切向流超濾系統(tǒng)膜包的分子量大小為100-500KD。
[0017] 優(yōu)選地，切向流超濾系統(tǒng)膜包的分子量大小為300KD。
[0018] 其中，步驟（2)和步驟（3)中抗原液在超濾系統(tǒng)中進行純化的同時需要將抗原液 濃縮至原體積1/10以上，收取回流液，棄去透過液。
[0019] 本發(fā)明方法中，所述的緩沖液為0. 01M pH值7. 2-7. 4的PBS緩沖液。
[0020] 抗原液泵入超濾系統(tǒng)進行純化時，抗原液進入超濾膜包的流速不超過0. 8ml/min/ cm2。
[0021] 本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明提供了藍耳病疫苗抗原純化的方法，為提高我國藍耳 病疫苗質(zhì)量提供新技術(shù)。該技術(shù)操作簡單，可操作性強，工藝穩(wěn)定，受人為因素影響較小，可 重復(fù)性強。純化的疫苗抗原蛋白去除率達到90%以上，抗原回收率達到100%。在藍耳病 疫苗生產(chǎn)中具有明顯的優(yōu)勢和巨大的應(yīng)用價值，對于降低藍耳病疫苗的免疫副反應(yīng)以及提 高疫苗產(chǎn)品質(zhì)量具有積極的意義。
【具體實施方式】
[0022] 以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神 和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。
[0023] 若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0024] 實施例1藍耳病活疫苗抗原純化
[0025] (1)將收獲的藍耳病活疫苗抗原先采用6000rpm離心30min，取上清棄沉淀，然后 將上清液以l〇〇〇〇rpm離心60min，取上清備用；
[0026] (2)將離心澄清后的抗原泵入分子量大小為300KD的切向流超濾系統(tǒng)進行純化， 進液速率為〇. 4ml/min/cm2,同時濃縮至原體積的1/10,棄去透過液，保留回流液；
[0027] (3)用無菌的PBS緩沖溶液將抗原濃縮液稀釋至原體積，繼續(xù)泵入超濾膜包進行 純化并將抗原液濃縮至原體積的1/10,進液速率為0. 4ml/min/cm2;所述PBS溶液pH值為 7.2，濃度為0.01111〇1/1;
[0028] (4)用無菌的PBS緩沖溶液（pH值為7. 2,濃度為0.0 lmol/L)將抗原濃縮液稀釋 至原體積，繼續(xù)泵入超濾膜包進行純化并濃縮至原體積1/10,進液速率為0. 4ml/min/cm2， 用PBS緩沖溶液稀釋至原體積，即可收獲純化后的藍耳病活疫苗抗原。
[0029] (5)將純化前后的藍耳病活疫苗抗原進行10倍系列稀釋后，接種96孔培養(yǎng)的單層 Marcl45細胞，每孔100 y 1，培養(yǎng)96小時，測定TCID5(I。根據(jù)純化前后抗原TCID5(I的大小計 算抗原回收率，結(jié)果見表1。
[0030] (6)用Lowry法測定純化前后總蛋白濃度，計算蛋白去除率，結(jié)果見表1。
[0031] 表1藍耳病活疫苗抗原純化結(jié)果
[0032]
【主權(quán)項】
1. 一種藍耳病疫苗抗原純化的方法，其特征在于，包括如下步驟： (1) 將收獲的藍耳病疫苗抗原經(jīng)離心機離心澄清，收取澄清的抗原液； (2) 將步驟（1)得到的澄清抗原液泵入超濾系統(tǒng)進行純化； (3) 用緩沖液將步驟（2)中純化得到的抗原液稀釋至原體積繼續(xù)純化； (4) 用緩沖液將步驟（3)中純化得到的抗原液稀釋至原體積繼續(xù)純化后，收獲純化的 藍耳病疫苗抗原。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（1)所述的藍耳病疫苗抗原為經(jīng)滅活 劑滅活后的藍耳病滅活疫苗抗原或藍耳病活疫苗抗原。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（1)采用差速離心的方法。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述差速離心為先采用4000-7000rpm離 心20-40min，取上清棄沉淀，然后將上清液以8000-12000rpm離心50-70min，取上清備用。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（2)中超濾系統(tǒng)為切向流超濾系統(tǒng)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，切向流超濾系統(tǒng)膜包的分子量大小為 100-500KD。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，切向流超濾系統(tǒng)膜包的分子量大小為 300KD。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（2)和步驟（3)中抗原液在超濾系統(tǒng) 中進行純化的同時需要將抗原液濃縮至原體積1/10以上，收取回流液，棄去透過液。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述緩沖液為0. 01M pH值7. 2-7. 4的PBS 緩沖液。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（2)中抗原液泵入超濾系統(tǒng)進行純 化時，抗原液循環(huán)進入超濾膜包的流速不超過0. 8ml/min/cm2。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種藍耳病疫苗抗原純化的方法，屬于生物制品制備技術(shù)領(lǐng)域。該純化方法包括如下步驟：(1)將收獲的藍耳病疫苗抗原離心澄清；(2)將步驟(1)得到的澄清抗原泵入超濾系統(tǒng)中進行純化；(3)用緩沖液將步驟(2)中純化得到的抗原液稀釋至原體積繼續(xù)純化；(4)用緩沖液將步驟(3)中純化得到的抗原液稀釋至原體積繼續(xù)純化一段時間后，收獲純化的藍耳病疫苗抗原。該方法對于降低藍耳病疫苗的免疫副反應(yīng)以及提高疫苗產(chǎn)品質(zhì)量具有積極的意義。
【IPC分類】C12N7-04
【公開號】CN104673761
【申請?zhí)枴緾N201510056212
【發(fā)明人】黃文強, 丁錦茂, 潘德春, 楊君敬, 吳宗學(xué), 王賀民
【申請人】乾元浩生物股份有限公司
【公開日】2015年6月3日
【申請日】2015年2月3日