利用CRISPR-Cas9特異敲出microRNA基因家族的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及CRISPR-Cas9特異敲出microRNA基因的方法以及特異靶向sgRNA的 設(shè)計。 (二）
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，我國醫(yī)藥行業(yè)發(fā)展很迅速，但是同時也存在著很多問題，例如研發(fā)基礎(chǔ)薄 弱、仿制國外專利泛濫、缺少自主知識產(chǎn)權(quán)等等，這些都嚴重制約著我國的醫(yī)藥行業(yè)發(fā)展。 因此，增強我國的藥品研發(fā)能力刻不容緩。藥物研發(fā)過程就是疾病致病機理和藥物靶標(biāo)篩 選的過程，篩選的過程大都借助于各類人類疾病的動物疾病模型，特別是與人親緣關(guān)系較 近的小鼠模型（包括轉(zhuǎn)基因和基因敲除）來分析疾病的發(fā)病機制和新型藥物的研發(fā)。決定 于小鼠的自身特點與人類相似如器官發(fā)育，生化生理代謝等，還取決于小鼠繁殖率高，取材 易等，極大的方便了研宄工作。目前，我國在疾病小鼠模型建立方面還起步晚，特別是在基 因修飾小鼠方面如轉(zhuǎn)基因/基因敲除方面，只有上海南方模式生物中心和南京大學(xué)模式生 物研宄所，他們產(chǎn)能有限，大部分研宄者還依賴進口，費用很高每只基因修飾小鼠大約需要 20萬，而且周期長，大大制約了我國醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此，在這種背景下，如何建立和研發(fā) 一種簡單高效快速廉價制備基因修飾小鼠模型的方法對我國醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展戰(zhàn)略有著重要 的意義。
[0003] 在動植物發(fā)育過程中，MicroRNA作為一類重要的調(diào)控因子參與基因的表達調(diào)控。 miRNA通過與特定mRNA的3'非翻譯區(qū)（UTR)結(jié)合，導(dǎo)致mRNA降解或以mRNA為模版的翻 譯過程受到抑制，從而達到負向調(diào)節(jié)某一基因表達的作用。miRNA功能的研宄對于進一步揭 示疾病的發(fā)生發(fā)展具有重大意義。
[0004] 研宄microRNA的方法主要是利用敲除microRNA使其功能喪失來研宄其作用。但 是大部分microRNA都以microRNA家族的形式調(diào)控基因表達；單獨敲除某個microRNA并不 能完全使得靶基因功能發(fā)生變化。而利用傳統(tǒng)方式構(gòu)建microRNA家族敲出動物模型步驟 繁雜且耗費人力物力；利用人工合成的microRNA拮抗劑對細胞進行轉(zhuǎn)染或者靜脈注射到 動物體內(nèi)，其應(yīng)用明顯不足：成本高，需要反復(fù)注射，其中，較為突出的是作用時間短和無法 傳代。有實驗表明，細胞轉(zhuǎn)染miRNA抑制劑后，最多可作用7天，這顯然無法滿足某些疾病 研宄的要求。無法傳代更是制約了一些胚胎發(fā)育的研宄。因此需要一種新的基因組修飾技 術(shù)來同時敲出多個mi croRNA。
[0005] CRISPR/Cas9技術(shù)是新興的一個基因修飾技術(shù)，該技術(shù)發(fā)現(xiàn)于菌和古細菌在長期 演化過程中形成的一種適應(yīng)性免疫防御，可用來對抗入侵的病毒及外源DNA。其原理主要是crRNA(CRISPR_derivedRNA)通過喊基配對與tracrRNA(trans-activatingRNA)結(jié)合形成 tracrRNA/crRNA復(fù)合物，此復(fù)合物引導(dǎo)核酸酶Cas9蛋白在與crRNA配對的序列靶位點剪切 雙鏈DNA。利用該系統(tǒng)不僅可以高效的修飾目的基因，同時一次可精確修飾多個目的基因。
[0006]目前，CRISPR/Cas9系統(tǒng)在基因組編輯方面有著很大的優(yōu)勢，可以定點刪除目的基 因。本發(fā)明利用該技術(shù)將miR-382家族miR-382和miR-154基因定點敲除，該技術(shù)敲除效 率高；同時操作步驟簡單。利用該技術(shù)進行轉(zhuǎn)基因具有獨特的優(yōu)勢具有高可控性和安全性， 降低了轉(zhuǎn)基因生物的風(fēng)險。 (三）

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明目的是提供一種高效定點敲除microRNA家族基因的方法，主要采用 CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除目的基因。這是首次利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)特異性的將micrRNA家 族敲除。利用這種新的方法可克服傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因的一次僅能敲除一個基因的弊端，加速了模 型生物的建立縮減至3周；同時構(gòu)建步驟簡單，也減少了昂貴的分子試劑。
[0008] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0009] 本發(fā)明提供一種利用CRISPR-Cas9特異敲除microRNA基因的方法，所述方 法為：（1)以px330質(zhì)粒為模板，在引物Cas9-R和含17啟動子的引物Cas9-F作用下 進行PCR反應(yīng)，將PCR反應(yīng)產(chǎn)物與pGME-T載體連接，獲得質(zhì)粒pGEM-Cas9，再將質(zhì)粒 pGEM-Cas9經(jīng)線性化、體外轉(zhuǎn)錄及RNA純化試劑盒回收，獲得Cas9mRNA;(2)以px330質(zhì) 粒為模板，在引物sgRNA-R和含17啟動子的引物sgRNA-F的作用下進行PCR反應(yīng)，再將 PCR擴增產(chǎn)物與載體pGEM-T連接，獲得載體pGEM-I7-sgRNA;(3)將SEQIDNO. 3所示的 miR-154sgRNA和SEQIDNO. 4 所示miR-382sgRNA分別與載體pGEM-17-sgRNA連接，分別 獲得質(zhì)粒I7-sgRNA-miR-382和質(zhì)粒I7-sgRNA-miR-154,經(jīng)線性化、體外轉(zhuǎn)錄及RNA純化 試劑盒回收，獲得T7-sgRNA-miR-382mRNA和T7-sgRNA-miR-154mRNA;(4)將Cas9mRNA、 T7-sgRNA-miR-382mRNA和I7-sgRNA-miR-154mRNA混合成混合液，注射哺乳類動物受精卵， 實現(xiàn)將microRNA基因定點敲除的目的；
[0010] Cas9-F:5' -TTAATACGACTCACTATAGGATGGACTATAAGGACCACGAC-3' ；
[0011] Cas9-R: 5 ' -GCGAGCTCTAGGAATTCTTAC-3 ' ；
[0012] sgRNA-F:5'-TTAATACGACTCACTATAGGGTGGAAAGGACGAAACACCGGGTCTTCGAGAAGAC CT-3'；
[0013]sgRNA-R:5 ' -AAAAGCACCGACTCGGTGCC-3 '。
[0014]進一步，所述每 20y1 混合液中Cas9mRNA、T7-sgRNA-miR-382mRNA和 T7-sgRNA-miR-154mRNA的濃度分別為 50ng/yl、100ng/y1 和 10ng/y1。
[0015] 進一步，所述哺乳類動物受精卵為小鼠受精卵。
[0016] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：
[0017] 1)構(gòu)建基因修飾小鼠在周期上大大縮短，減少至4個月；
[0018] 2)可以一次構(gòu)建多個基因的同時敲除；
[0019] 3)資金投入明顯減少，只需5萬元即可得到F1代小鼠；
[0020] 4)基因修飾效率可達90%以上，降低了傳統(tǒng)技術(shù)的不可靠性；
[0021] 5)操作技術(shù)簡單，無需通過復(fù)雜的打靶載體構(gòu)建、ES細胞篩選、嵌合體小鼠選育 等一系列步驟。
[0022] 因此，CRISPR/Cas9技術(shù)制備基因修飾小鼠具有很大的優(yōu)勢，簡單快捷實惠，在經(jīng) 費有限的情況下完全可以制備出小鼠模型。 (四）
【附圖說明】
[0023] 圖1為利用CRISPR/cas9敲除miR-382家族基因構(gòu)建模式圖。
[0024] 圖2為Cas9表達載體PCR擴增產(chǎn)物電泳圖，泳道M為標(biāo)準分子，泳道cas9為Cas9 表達載體PCR擴增產(chǎn)物。
[0025] 圖3為Cas9mRNA體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物電泳圖，泳道M為標(biāo)準分子，泳道cas9mRNA為 pGEM_Cas9載體體外轉(zhuǎn)錄物。
[0026] 圖4為T7-sgRNA表達載體PCR產(chǎn)物電泳圖，泳道M為標(biāo)準分子，泳道pGEM-sgRNA 為sgRNA的PCR擴增產(chǎn)物。
[0027] 圖5為miR-382家族sgRNA體外轉(zhuǎn)錄電泳圖，泳道M為標(biāo)準分子，泳道m(xù)iR-154為 T7-sgRNA-miR-154體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物電泳圖，泳道m(xù)iR-382為I7-sgRNA-miR-382體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 電泳圖。
[0028] 圖6為miR-382家族缺失序列。
[0029] 圖7為miR-382敲除后心臟圖片。 (五）【具體實施方式】
[0030] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于 此：
[0031] 下述實施例中所用材料、試劑等，如無特別說明，均可從商業(yè)途徑獲得。
[0032]pGEM-T載體購自Promega公司，產(chǎn)品目錄號A3600。LATaq購自TAKARA，產(chǎn)品目 錄號RR02MA。
[0033] 實施例1
[0034] 1、構(gòu)建體外Cas9表達載體，命名為pGEM-Cas9,序列如SEQIDNO. 1，時間為3天。
[0035] (1)引物設(shè)計
[0036] 以pX330(Addgene:42330)序列為模板，設(shè)計引物Cas9-F(下劃線部分為17啟動 子序列）和引物Cas9_R。
[0037]Cas9-F：
[0038] 5，_TTAATACGACTCACTATAGGATGGACTATAAGGACCACGAC-3，；
[0039] Cas9-R : 5，-GCGAGCTCTAGGAATTCTTAC-3，〇
[0040] (2)PCR擴增
[0041] 以px330為模板，在引物Cas9_F和引物Cas9_R的作用下進行PCR反應(yīng)，擴增產(chǎn)物 進行凝膠電泳分析，獲得目的片段大小為5309bp，如圖2所示。
[0042] PCR反應(yīng)體系為：
[0043]
【主權(quán)項】
1. 一種利用CRISPR-Cas9特異敲除microRNA基因家族的方法，其特征在于所述 方法為：（1)以px330質(zhì)粒為模板，在引物Cas9-R和含T7啟動子的引物Cas9-F作用 下進行PCR反應(yīng)，將PCR反應(yīng)產(chǎn)物與pGME-T載體連接，獲得質(zhì)粒pGEM-Cas9,再將質(zhì)粒 pGEM-Cas9經(jīng)線性化、體外轉(zhuǎn)錄及RNA純化試劑盒回收，獲得Cas9mRNA ; (2)以px330質(zhì) 粒為模板，在引物SgRNA-R和含T7啟動子的引物SgRNA-F的作用下進行PCR反應(yīng)，再將 PCR擴增產(chǎn)物與載體pGEM-T連接，獲得載體pGEM-T7-sgRNA;(3)將SEQ ID NO. 3所示的 miR-154sgRNA 和 SEQ ID NO. 4 所示 miR-382sgRNA 分別與載體 pGEM-T7-sgRNA 連接，分別 獲得質(zhì)粒T7-sgRNA-miR-382和質(zhì)粒T7-sgRNA-miR-154,經(jīng)線性化、體外轉(zhuǎn)錄及RNA純化 試劑盒回收，獲得 T7-sgRNA-miR-382mRNA 和 T7-sgRNA-miR-154mRNA ; (4)將 Cas9mRNA、 T7-sgRNA-miR-382mRNA和T7-sgRNA-miR-154mRNA混合成混合液，注射哺乳類動物受精卵， 實現(xiàn)將microRNA基因定點敲除的目的； Cas9-F :5' -TTAATACGACTCACTATAGGATGGACTATAAG GACCACGAC-3' ； Cas9-R:5' -GCGAGCTCTAGGAATTCTTAC-3' ； sgRNA-F :5' -TTAATACGACTCACTATAGGGTGGAAAGGACGAAACA CCGGGTCTTCGAGAAGACCT-3' ； SgRNA-R :5' -AAAAGCACCGACTCGGTGCC-3'。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述每20 μ 1混合液中Cas9mRNA、 T7-sgRNA-miR-382mRNA 和 T7-sgRNA-miR-154mRNA 的濃度分別為 50ng/ μ IUOOng/ μ 1 和 IOng/μ I。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述哺乳類動物受精卵為小鼠受精卵。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用CRISPR-Cas9特異敲除microRNA基因家族的方法，主要采用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除目的基因。這是首次利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)特異性的將micrRNA家族敲除。利用這種新的方法可克服傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因的一次僅能敲除一個基因的弊端，加速了模型生物的建立縮減至3周；同時構(gòu)建步驟簡單，也減少了昂貴的分子試劑；本發(fā)明構(gòu)建基因修飾小鼠在周期上大大縮短，減少至4個月；可以一次構(gòu)建多個基因的同時敲除；資金投入明顯減少，只需5萬元即可得到F1代小鼠；基因修飾效率可達90％以上，降低了傳統(tǒng)技術(shù)的不可靠性；操作技術(shù)簡單，無需通過復(fù)雜的打靶載體構(gòu)建、ES細胞篩選、嵌合體小鼠選育等一系列步驟。
【IPC分類】C12N15-85, A01K67-027
【公開號】CN104651398
【申請?zhí)枴緾N201410815915
【發(fā)明人】黃華榮, 陳勇龍, 羊雪芹, 包美玲, 曹歡歡, 張遵義
【申請人】杭州師范大學(xué)
【公開日】2015年5月27日
【申請日】2014年12月24日