利用ii型曲霉菌胃蛋白酶制備明膠的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于一種通過對膠原進行酶處理來制備明膠的方法。
【背景技術】
[0002] 明膠是通過使膠原增溶而獲得的肽和蛋白質(zhì)的混合物。膠原主要是通過使用堿或 酸預處理從各種動物副產(chǎn)品（例如骨和表皮）提取而來。
[0003] 傳統(tǒng)上，明膠可使用熱水從膠原中提取，其中進行多級提取以使膠原增溶成明膠。 通常，可使用三個熱水提取溫度級：（l)50-55°c ;(2)60-65°C ;和（3)70-75°C。提取中所用 的水溫越高，則獲得的膠原增溶越高，而明膠強度越低。膠原包含三條多肽鏈，所謂的a鏈 (a、a 1和a 2)，這些膠原肽在提取期間被增溶。增溶后，可對明膠（增溶的膠原）進行進 一步的處理，例如過濾、澄清和干燥。
[0004] 使用熱水提取明膠的缺點是浸灰（liming)工藝和提取工藝需要大量的水和較長 的時間。
[0005] 作為替代，已描述用于從膠原中提取明膠的酶法工藝。酶通常用于改進或代替明 膠工藝中的預處理步驟（例如浸灰），或用于提高較低溫度下熱水提取期間的明膠產(chǎn)率。
[0006] CN102051130比較了酸性蛋白酶、胃蛋白酶（P印sin)和若干種中性蛋白酶用于從 脫脂脫礦的骨中提取明膠的用途。CN102051130中所公開的方法的缺點是明膠提取中仍需 要大量的水，并且要施加額外的加熱步驟來獲得高明膠產(chǎn)率。
[0007] CN102329843公開了來自黑曲霉（A. niger)的酸性蛋白酶用于從骨膠原中提取明 膠的用途，其中酶促反應需要小心控制以防止酶過度反應。
[0008] 本領域中已知的用于明膠提取的酶法的缺點是膠原的非特異性蛋白水解裂解。所 用廣譜蛋白酶如果未經(jīng)小心控制就會產(chǎn)生小的蛋白質(zhì)片段，并因此而降低明膠質(zhì)量。
[0009] 本發(fā)明的目的是提供一種用于酶法提取明膠的改進的方法，其中以高產(chǎn)率獲得高 質(zhì)量的明膠。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明涉及一種制備明膠的方法，其包括用包含與SEQ ID NO: 1具有至少70%同 一性的酸性蛋白酶的酶組合物溫育含膠原的材料的步驟，以及制備明膠。
[0011] 出人意料地發(fā)現(xiàn)，在用本文所公開的包含酸性蛋白酶的酶組合物溫育含膠原的材 料的步驟期間，明膠產(chǎn)率高于用本領域已知的酶法所獲得的明膠產(chǎn)率，同時保持了非常良 好的明膠質(zhì)量。本文所用的高產(chǎn)率為至少為60重量％，或至少為70重量％，或至少為75 重量％的產(chǎn)率，良好的質(zhì)量是指明膠的布盧姆值（Bloom value)為至少200,例如至少240 或至少260。無需諸如加熱處理的進一步的提取步驟，在用酸性蛋白酶溫育膠原材料的步驟 中存在這些高產(chǎn)率值。因此這些進一步的提取步驟可省略，本文所公開的制備明膠的方法 可有利地降低生產(chǎn)成本。
[0012] 在另一個實施方式中，本發(fā)明涉及具有相對于膠原a肽的重量至少10重量/重 量％的大小為70至90kDa肽的明膠。
[0013]發(fā)明詳沐
[0014] 本發(fā)明涉及一種制備明膠的方法，其包括用包含與SEQIDNO: 1氨基酸序列具有 至少70%同一性的酸性蛋白酶的酶組合物溫育含膠原的材料的步驟，以及制備明膠。
[0015] 本文所用的方法中的酸性蛋白酶為最佳pH值為酸性pH值（例如介于1和6之間， 或介于2和5之間，或介于3和4之間）的蛋白酶。
[0016] 本文所公開的方法中有利地使用酸性蛋白酶，因為其產(chǎn)生具有高布盧姆值和良好 膠凝性質(zhì)的明膠。與已知的蛋白酶相比，本文所公開的方法中使用的酸性蛋白酶似乎可將 膠原裂解成比本領域中已知的蛋白酶組合物更大的片段。
[0017] 酸性蛋白酶可為傾向于在蛋白質(zhì)或肽的某個特定氨基酸位置對所述蛋白質(zhì)或肽 進行裂解的酶。酸性蛋白酶可例如為組氨酸特異性蛋白酶。已發(fā)現(xiàn)，當在本文所公開的蛋 白酶中使用組氨酸特異性蛋白酶時，可獲得高質(zhì)量的明膠。
[0018] 本文所公開的方法中的酸性蛋白酶不是廣譜蛋白酶。
[0019] 酶組合物有利地包含酸性蛋白酶，其中所述酸性蛋白酶占所述酶組合物中的蛋白 質(zhì)的重量百分比至少為80%，例如占所述酶組合物中的蛋白質(zhì)的重量百分比至少為85%、 90 %、95 %、98 %或99 %。已發(fā)現(xiàn)，包含重量百分比至少為80 %的酸性蛋白酶蛋白質(zhì)的酶組 合物產(chǎn)生良好質(zhì)量的明膠。通過本文所公開的方法制備的良好質(zhì)量的明膠包含相對于明膠 中膠原a肽的重量至少10重量/重量％的大小為70至90kDa的蛋白質(zhì)。
[0020] 因此，本文所公開的方法中的酶組合物包含呈純形式的酸性蛋白酶。
[0021] 所述酸性蛋白酶可與SEQIDN0:1氨基酸序列具有至少75%、80%、85%、90%、 92%、95%、98%、99%或100%同一性，或可包含5已〇10勵：1。
[0022] 所述酸性蛋白酶可源自任何合適的微生物，例如源自Rasamsonia、青霉菌 (Penicillium)或曲霉菌（Aspergillus)屬的真菌。優(yōu)選地，酸性蛋白酶源自以下的種：踝 節(jié)菌屬埃默森藍狀菌（Rasamsonis emersonii)、產(chǎn)黃青霉菌（Penicillium chrysogenum)、 米曲霉（Aspergillus oryzae)或黑曲霉（Aspergillus niger) 〇
[0023] 用包含酸性蛋白酶的酶組合物溫育含膠原的材料可在介于40°C和65°C之間，例 如介于45°C和60°C之間，例如介于50°C和59°C之間，或介于52°C和58°C之間的溫度下進 行。
[0024] 用酶組合物溫育含膠原的材料可在介于1. 0和4. 5之間的pH，例如介于1. 5和4 之間的pH，例如介于2. 0和3. 5之間的pH下進行。
[0025] 已發(fā)現(xiàn)，本文所公開的制備制備明膠的方法與熱水、酸或堿工藝相比可在更短的 時間段內(nèi)進行，這具有較大的經(jīng)濟利益。用包含酸性蛋白酶的酶組合物溫育含膠原的材料 可在介于〇. 5小時和10小時之間，例如于1小時和8小時之間或介于2小時和6小時之間 的時段內(nèi)進行。
[0026] 本文所公開的方法中制備的明膠包括使膠原增溶。使膠原增溶包括各個膠原鏈或 肽之間的分子（例如氫）的部分水解或裂解。已發(fā)現(xiàn)，通過本文所公開的方法中的用酸性 蛋白酶溫育膠原，與用本領域中已知的酸性蛋白酶獲得的增溶的膠原的量相比，可使更高 量的膠原增溶。本文所公開的制備明膠的方法還可包括將增溶的膠原與不溶性膠原分離。
[0027] 所述制備明膠的方法可包括干燥明膠的另外的步驟。
[0028] 在一個實施例中，本發(fā)明涉及包含相對于明膠中膠原a肽的重量至少10重量/ 重量％的大小為70至90kDa的肽的明膠。所述明膠優(yōu)選地包含量為相對于膠原a肽的重 量至少10至90重量/重量％或至少20至80重量/重量％或至少30至70重量/重量％ 的大小為70至90kDa的肽。所述肽的大小可介于72至88kDa，或介于74至86kDa，例如介 于 76 至 84kDa。
[0029] 本發(fā)明還涉及一種制備包含相對于明膠中膠原a肽的重量至少10重量/重量％ 的大小為70至90kDa的蛋白質(zhì)的明膠的方法，如本文上文中進一步所定義的。
[0030] 在一個實施方式中，本發(fā)明還涉及通過本文所公開的方法可獲得的明膠。
[0031] 定義
[0032] 來自IUMB的對酶的分類和命名的國際公認的方案包括蛋白酶。該體系將蛋白酶 分類成內(nèi)切蛋白酶和外切蛋白酶。內(nèi)切蛋白酶在本文中被定義為以內(nèi)切方式水解多肽中的 肽鍵并且屬于EC 3. 4類的酶。內(nèi)切蛋白酶根據(jù)催化機制分為亞-亞類。存在絲氨酸內(nèi)切蛋 白酶（EC 3. 4. 21)、半胱氨酸內(nèi)切蛋白酶（EC 3. 4. 22)、天冬氨酸內(nèi)切蛋白酶（EC 3. 4. 23)、 金屬內(nèi)切蛋白酶（EC 3.4. 24)和蘇氨酸內(nèi)切蛋白酶（EC 3.4. 25)的亞-亞類。
[0033] 序列同一性在本文中被定義為通過比較序列測定的兩條或更多條氨基酸（多肽 或蛋白質(zhì)）序列之