一種穩(wěn)定表達(dá)人凝血八因子的cho細(xì)胞株及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別設(shè)及一種穩(wěn)定表達(dá)人凝血八因子的CK)細(xì)胞株及 其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 甲型血友病是由于人體凝血八因子缺乏或者不正常而導(dǎo)致的一種凝血功能障礙 疾病，其主要表現(xiàn)是，活性凝血活酶生成障礙，凝血時(shí)間延長(zhǎng)，輕微創(chuàng)傷后即出現(xiàn)出血傾向。 凝血八因子在凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)中作為活化型的九因子的輔因子激活十因子，進(jìn)而刺激內(nèi)源性 凝血反應(yīng)的發(fā)生。甲型血友病該種遺傳性的凝血功能障礙疾病是由于患者體內(nèi)的凝血八因 子的量不足或者質(zhì)有缺陷，大約每5000個(gè)男性中出現(xiàn)一例甲型血友病患者。全球大約有10 萬人患有甲型血友病，國(guó)內(nèi)大約2萬人患有血友病，但是由于國(guó)外拜耳，惠氏等產(chǎn)品價(jià)格昂 貴，W及進(jìn)出口限制，導(dǎo)致很多人沒有治療藥物。
[0003] 中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（CH0)是較為成熟的表達(dá)外源蛋白的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，具有多 年的實(shí)踐運(yùn)用經(jīng)驗(yàn)。010細(xì)胞易于大規(guī)模培養(yǎng)，外源基因易于穩(wěn)定整合入細(xì)胞的基因組，在 表達(dá)外源蛋白中具有較大優(yōu)勢(shì)。
[0004] 自20世紀(jì)70年代，從血漿純化提取來源的凝血八因子已經(jīng)出現(xiàn)，但是需要嚴(yán)格的 血漿供體篩選W及復(fù)雜的病毒減毒工藝W減少病毒交叉感染。1992年從轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì) 胞中產(chǎn)生了重組凝血八因子，其在生化及凝血功能方面與血漿來源八因子性質(zhì)一樣，與血 漿來源八因子也有相同的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，半衰期均為12小時(shí)左右。
[0005] 國(guó)內(nèi)治療血友病藥物凝血八因子生產(chǎn)廠家華蘭生物，北京天壇生物，上海生物制 品研究所均是通過血漿提取得到凝血八因子，但是血漿來源的凝血八因子有W下缺陷： 1.血漿來源有限；2.血漿若含有病毒，則容易造成交叉感染，而基因重組獲得的人凝血八 因子則克服了 W上缺陷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 鑒于W上所述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的在于提供一種穩(wěn)定表達(dá)人凝血八因 子的CH0細(xì)胞株及其應(yīng)用，用于解決現(xiàn)有技術(shù)中的問題。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)上述目的及其他相關(guān)目的，本發(fā)明第一方面提供一種穩(wěn)定表達(dá)人凝血八因 子的CH0細(xì)胞株，所述細(xì)胞株的名稱為；中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞CH0-S/H9C2,所述細(xì)胞株的保藏 號(hào)為；CCTCC No ;C2014191。
[000引本發(fā)明所述的穩(wěn)定表達(dá)人凝血八因子的Cffi)細(xì)胞株，能夠穩(wěn)定表達(dá)人凝血八因 子，該細(xì)胞株能夠分泌表達(dá)人凝血八因子到細(xì)胞培養(yǎng)上清液中，所分泌的人凝血八因子能 夠通過凝血八因子試劑盒檢測(cè)（如Coamatic FVHI試劑盒，貨號(hào)；N0148543,化romogenix， 意大利）。該細(xì)胞株在細(xì)胞傳代40次后，人凝血八因子的表達(dá)水平穩(wěn)定，即在相同的培養(yǎng) 條件下，細(xì)胞傳代40次后，通過活性試劑盒檢測(cè)，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中人凝血八因子保持在 7IU/ml0
[0009] 本發(fā)明所述的穩(wěn)定表達(dá)人凝血八因子的c冊(cè)細(xì)胞株宿主細(xì)胞為CHO-S細(xì)胞，帶有 綠色巧光和G418抗性作為篩選標(biāo)簽，基因組中帶有能夠被確認(rèn)的特征序列。
[0010] 具體來說，所述細(xì)胞株所帶有的綠色巧光標(biāo)簽，能夠在巧光顯微鏡下顯著地觀察 到 ;通過流式細(xì)胞儀的FITC-H通道檢測(cè)，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的該細(xì)胞株的綠色巧光強(qiáng)度與宿 主細(xì)胞CH0-S有顯著的差異。此外，該細(xì)胞株基因組中帶有的如SEQ ID No. 1所示的特征 序列能夠用PCR法進(jìn)行擴(kuò)增，并用測(cè)序的方法予W確認(rèn)。
[0011] 本發(fā)明第二方面提供所述穩(wěn)定表達(dá)人凝血八因子的CK)細(xì)胞株在人凝血八因子 制備領(lǐng)域的應(yīng)用。
[0012] 本發(fā)明所述的CH0細(xì)胞株能夠運(yùn)用于人凝血八因子的制備，所述細(xì)胞株可使用無 血清培養(yǎng)基長(zhǎng)時(shí)間，所分泌的人凝血八因子能夠通過凝血八因子檢測(cè)試劑盒檢測(cè)，細(xì)胞傳 代40次后，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中人凝血八因子表達(dá)量可達(dá)7lU/ml。
[0013] 本發(fā)明第S方面提供一種人凝血八因子，由保藏號(hào)為CCTCC No ;C2014191的CH0 細(xì)胞株或其傳代細(xì)胞株分泌產(chǎn)生，所述人凝血八因子能夠通過凝血八因子檢測(cè)試劑盒檢 測(cè)。
[0014] 本發(fā)明實(shí)施例中使用的Coamatic FVIII試劑盒是診斷人體內(nèi)的凝血八因子含量 的，所W用該個(gè)試劑盒檢測(cè)說明我們細(xì)胞株所表達(dá)的凝血八因子具有跟人體內(nèi)凝血八因子 相同的生物活性。
[0015] 本發(fā)明第四方面提供所述穩(wěn)定表達(dá)人凝血八因子的CK)細(xì)胞株和所述人凝血八 因子在制備檢測(cè)試劑或診斷試劑中的應(yīng)用。
[0016] 如上所述，本發(fā)明所述的穩(wěn)定表達(dá)人凝血八因子的CK)細(xì)胞株，能夠穩(wěn)定表達(dá)人 凝血八因子，細(xì)胞傳代40次后，通過活性試劑盒檢測(cè)，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中人凝血八因子保 持在7IU/ml W上。
【附圖說明】
[0017] 圖1顯示為本發(fā)明C冊(cè)細(xì)胞株H9C2的7天生長(zhǎng)曲線；
[001引 圖2顯示為本發(fā)明CH0細(xì)胞株H9C2的7天人凝血八因子表達(dá)曲線；
[0019] 圖3顯示為本發(fā)明CH0細(xì)胞株傳代40次人凝血八因子表達(dá)曲線；
[0020] 圖4顯示為本發(fā)明CH0細(xì)胞株H9C2的放大100倍的巧光照片；
[0021] 圖5顯示為本發(fā)明C冊(cè)細(xì)胞株H9C2和CH0-S細(xì)胞用流式細(xì)胞儀的FITC-H通道檢 測(cè)綠色巧光；
[002引圖6是通過PCR擴(kuò)增C冊(cè)細(xì)胞株H9C2基因組的特征序列片段；
[0023] 圖7顯示為本發(fā)明C冊(cè)細(xì)胞株H9C2中質(zhì)粒與市場(chǎng)上第四代產(chǎn)品Xythna質(zhì)粒在人 凝血八因子B結(jié)構(gòu)域內(nèi)保留不同的氨基酸殘基。
【具體實(shí)施方式】
[0024] W下通過特定的具體實(shí)例說明本發(fā)明的實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說明書 所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)與功效。本發(fā)明還可W通過另外不同的具體實(shí) 施方式加W實(shí)施或應(yīng)用，本說明書中的各項(xiàng)細(xì)節(jié)也可W基于不同觀點(diǎn)與應(yīng)用，在沒有背離 本發(fā)明的精神下進(jìn)行各種修飾或改變。
[0025] 在進(jìn)一步描述本發(fā)明【具體實(shí)施方式】之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于下 述特定的具體實(shí)施方案；還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明實(shí)施例中使用的術(shù)語是為了描述特定的具體 實(shí)施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍；在本發(fā)明說明書和權(quán)利要求書中，除非文中 另外明確指出，單數(shù)形式"一個(gè)"、"一"和"該個(gè)"包括復(fù)數(shù)形式。
[0026] 當(dāng)實(shí)施例給出數(shù)值范圍時(shí)，應(yīng)理解，除非本發(fā)明另有說明，每個(gè)數(shù)值范圍的兩個(gè)端 點(diǎn)W及兩個(gè)端點(diǎn)之間任何一個(gè)數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和 科學(xué)術(shù)語與本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實(shí)施例中使用的具體方法、設(shè)備、 材料外，根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可W使用與本 發(fā)明實(shí)施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來實(shí) 現(xiàn)本發(fā)明。
[0027] 除非另外說明，本發(fā)明中所公開的實(shí)驗(yàn)方法、檢測(cè)方法、制備方法均采用本技術(shù) 領(lǐng)域常規(guī)的分子生物學(xué)、生物化學(xué)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和分析、分析化學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、重組DNA技 術(shù)及相關(guān)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。該些技術(shù)在現(xiàn)有文獻(xiàn)中已有完善說明，具體可參見Sambrook 等 MOLECULAR CLONING ;A LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spring Harbor L油oratory Press，1989and "Third edition，2001;Ausubel 等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,John Wiley&Sons,New York,1987and periodic updates ；the series MET冊(cè)DS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego ;Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Iliird edition, Academic Press, San Diego, 1998 ;METH0DS IN ENZYMOLOGY， Vol. 304,Chromatin(P. M. Wassarman and A. P. Wolffe，eds. )，Academic Press，San Diego， 1999;和 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, Chromatin Protocols(P.B. Becker, ed. )Humana Press, Totowa，1999 等。
[00測(cè) 實(shí)施例1
[0029] 使用C冊(cè)細(xì)胞株H9C2制備凝血八因子；
[0030] 1實(shí)驗(yàn)方法
[0031] CH0細(xì)胞株H9C2的7天連續(xù)培養(yǎng)
[003引 將保藏號(hào)為CCTCC No ;C2014191的C冊(cè)細(xì)胞株冊(cè)C2按照IX