醇溶劑，并濃縮 提取液體。
[0041] 4?微波輔助提取原花青素
[0042] 1)在550W微波條件下進(jìn)行微波處理，時(shí)間為lOmin，微波設(shè)置短時(shí)間多次破碎 方式，每次微波時(shí)間為〇. 5s，間隔時(shí)間為0. 5s。期間如反應(yīng)液溫度超過設(shè)定的報(bào)警溫度 (45°C)則微波停止。
[0043] 2)離心處理：將經(jīng)過微波處理過的提取液在3000r/min下離心lOmin。
[0044] 5?真空濃縮
[0045] 1)取離心后的上清液，在35°C下真空濃縮。
[0046] 2)將得到的濃縮上清用0. 45yM的濾膜進(jìn)行過濾、濃縮。
[0047] 6.制備葡萄原花青素凍干粉
[0048] 1)將得到的濃縮上清用0? 22yM過濾除菌。
[0049]2)除菌后進(jìn)行凍干處理，凍干溫度為_25°C，真空度為lOOPa，凍干時(shí)間為28小時(shí)， 即得到葡萄果原花青素成分凍干粉。將凍干粉分裝成lml/支。
[0050] 7.原花青素含量的測定
[0051] 1)測定原理：原花青素和兒茶素類單體的A環(huán)化學(xué)活性較高，在酸性條件下，其上 的間苯二酚或間苯三酚與香草醛發(fā)生縮合反應(yīng)，產(chǎn)物在濃酸作用下形成有色的正碳離子， 樣品的濃度與產(chǎn)生的顏色呈正相關(guān)，在500nm波長下測定其吸收光度。
[0052] 2)測定方法：香草醛-硫酸法測定
[0053]A?標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：配制0? 025~0? 25ii mol/ml兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品甲醇溶液，依次加 入0. 5ml不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液、2. 5ml的1%香草醛-甲醇溶液及2. 5ml的30%H2S04-甲 醇溶液，混勻后于30°C水浴避光反應(yīng)15min后于500nm處測定吸光值。以吸光值A(chǔ)為橫坐 標(biāo)，原花青素濃度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0054] B.樣液含量測定：將實(shí)施例1制得的原花青素濃縮液稀釋到0. 05~0. 25ii mol/ ml，精密移取0. 5ml待測液，加入2. 5ml香草醛-甲醇溶液和及2. 5ml的30%H2S04-甲醇 溶液，混勻后于30°C水浴避光反應(yīng)15min。空白對(duì)照為無水甲醇。
[0055] C?原花青素含量的計(jì)算方式：
[0056]原花青素（％ ) = (CXNXV+M)X100%
[0057] C一稀釋后提取液中原花青素濃度（mg/ml);
[0058]N-提取液稀釋倍數(shù)；
[0059] V-提取液體積，ml;
[0060]M-葡萄質(zhì)量，mg。
[0061] 結(jié)果表明：按照本發(fā)明的提取方法，并根據(jù)上述原花青素含量的計(jì)算公式可以得 到葡萄果和葡萄皮中的原花青素提取率，其含量為42. 67%，相對(duì)現(xiàn)有的技術(shù)方法，其提取 率相對(duì)大大地提高。
[0062] 8?原花青素的鑒定
[0063] 1)鑒定原理：原花青素本身屬于多酚類物質(zhì)的一種，因而可以用鑒定多酚的方 式，即使用薄層層析來鑒定原花青素。薄層層析法（吸附色譜），吸附性薄層色譜法是將吸 附劑在光潔的表面上均勻地鋪成薄層，而后在在上面點(diǎn)上樣品，以流動(dòng)相開展，這樣樣品組 分不斷地被吸附劑吸附，而被流動(dòng)相溶解，解吸而向前移動(dòng)。由于吸附劑對(duì)不同組分有不同 的吸附能力，流動(dòng)相也有不同的解吸能力，因而流動(dòng)相在向前移動(dòng)的過程中，不同組分的物 質(zhì)將被分開。如果各組分本身有顏色則薄層板干燥后會(huì)出現(xiàn)一些列高低不同的斑點(diǎn)，如果 本身沒有顏色，則可用各種顯色方法使之顯色。
[0064] 2)測定方法：制備所需的層析板，將實(shí)施例1制備的原花青素濃縮液在薄層上展 開。
[0065] 3)測定結(jié)果：在薄層層板上會(huì)出現(xiàn)一個(gè)淡黃色色斑，向其噴顯色劑，出現(xiàn)藍(lán)色，證 明所分離得到的提取產(chǎn)物為多酚類原花青素。
[0066] 實(shí)施例2
[0067]具體的制備方法與實(shí)施例1基本相同，不同的是：
[0068] 步驟2中甲醇、乙醇和水溶液按體積比為0.5:1:2配制成混合溶液，步驟3中 在-0. 30mPa的條件下進(jìn)行負(fù)壓凍溶。步驟4中微波輔助提取原花青素時(shí)，首先，在550W 微波條件下進(jìn)行微波處理，時(shí)間為15min，微波設(shè)置短時(shí)間多次破碎方式，每次微波時(shí)間為 〇.8s，間隔時(shí)間為0.5s。期間如反應(yīng)液溫度超過設(shè)定的報(bào)警溫度（45°C)則微波停止。最 后,離心處理時(shí)將經(jīng)過微波處理過的提取液在2000r/min下離心20min。
[0069] 將實(shí)施例2制得的原花青素用于以下動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
[0070] 取昆明種小鼠50只（每只體重在15g~20g)，隨機(jī)分成5組：空白對(duì)照組、模型 對(duì)照組、原花青素高、中、低三個(gè)劑量組，分別記為A、B、C、D、E組。對(duì)C、D、E組分別灌服用 150、100、50mg/kg體重的原花青素，A組給予同體積蒸餾水。4周后處死動(dòng)物，用生化的方 法測定局部的S0D和HYP含量，其具體結(jié)果如下：
[0071]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種葡萄果中原花青素提取物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 準(zhǔn)備葡萄皮和葡萄果肉：將葡萄果剔除葡萄籽得到葡萄皮和葡萄果肉； (2) 萃取原花青素：按體積比為（0. 5-2) : (0. 5-2) : (0. 5-2)配置甲醇、乙醇和水溶液成 混合溶液，將混合溶液與步驟（1)準(zhǔn)備的葡萄皮和葡萄果肉混合，反應(yīng)12-36小時(shí)； (3) 步驟（2)反應(yīng)后，將反應(yīng)物進(jìn)行固液分離得到提取液，在（-0. 30MPa)-(-0.05MPa) 的條件下，對(duì)提取液用水凍溶，并濃縮； (4) 微波提取原花青素：在400-650W微波條件下對(duì)提取液處理6-15min，離心； (5) 濃縮：將步驟（4)離心后的上清液進(jìn)行濃縮，得到濃縮的原花青素提取液。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種葡萄果中原花青素提取物的制備方法，其特征在于，將 步驟（1)中所述葡萄皮和葡萄果肉搗碎。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種葡萄果中原花青素提取物的制備方法，其特征在于，步 驟（2)中所述甲醇、乙醇和水的體積比為1:1:1，所述混合溶液與步驟（1)準(zhǔn)備的葡萄皮和 葡萄果肉混合后反應(yīng)24小時(shí)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種葡萄果中原花青素提取物的制備方法，其特征在于，步 驟（3)中將所述固液分離得到提取液在-0. lOMPa下用0°C以下的水凍溶；步驟（4)中在 550W微波條件下對(duì)所述提取液處理。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種葡萄果中原花青素提取物的制備方法，其特征在于，步 驟（4)中所述對(duì)提取液處理采用短時(shí)間多次微波處理的方式，每次微波時(shí)間為0.3-0. 8S， 時(shí)間間隔為〇. 3-0. 8S。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種葡萄果中原花青素提取物的制備方法，其特征在于，步 驟（4)中每次微波時(shí)間為0. 5S，時(shí)間間隔為0. 5S，提取液溫度超過40-50°C則反應(yīng)停止；所 述微波處理過的提取液在2000-4000r/min下離心5_20min。
7. -種將權(quán)利要求1所述的方法制得的葡萄果中原花青素提取物制成原花青素凍干 粉的方法，其特征在于包括以下步驟： (1) 過濾：收集濃縮的原花青素提取液，用孔徑小于0. 45 y M的濾膜過濾； (2) 濃縮：濃縮上清液； (3) 過濾：將濃縮的上清液采用孔徑小于0. 22 y M的濾膜過濾； (4) 凍干處理：凍干溫度為（_20°C )-(_35°C )，真空度為50-200Pa，凍干時(shí)間為24-36 小時(shí)，即得到原花青素凍干粉。
8. 權(quán)利要求7所述的方法制得的原花青素凍干粉在抗衰老護(hù)膚品中應(yīng)用。
9. 如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于：所述抗衰老護(hù)膚品為面膜、爽膚水、面霜、乳 液、眼霜、洗面乳。
10. 如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于：所述原花青素凍干粉在抗衰老護(hù)膚品中的 添加量為1-1000 y g/ml。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種葡萄果中原花青素提取物的制備方法，包括以下步驟：(1)準(zhǔn)備葡萄皮和葡萄果肉：將葡萄果剔除葡萄籽得到葡萄皮和葡萄果肉；(2)萃取原花青素：配置甲醇、乙醇和水溶液成混合溶液，將混合溶液與步驟(1)準(zhǔn)備的葡萄皮和葡萄果肉混合，反應(yīng)；(3)將反應(yīng)物進(jìn)行固液分離得到提取液，在負(fù)壓的條件下，對(duì)提取液用水凍溶，并濃縮；(4)微波提取原花青素：在550W微波條件下對(duì)提取液處理，離心；(5)濃縮：將離心后的上清液進(jìn)行濃縮，得到濃縮的原花青素提取液。本發(fā)明提取效率更高，提取的原花青素化合物具有抗衰老等功效，應(yīng)用于抗衰老美容行業(yè)中。
【IPC分類】C07D311-62, A61K8-49, A61Q19-08
【公開號(hào)】CN104628698
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510074121
【發(fā)明人】陳海佳, 王一飛, 葛嘯虎, 池詩源, 王小燕
【申請(qǐng)人】廣州賽萊拉干細(xì)胞科技股份有限公司
【公開日】2015年5月20日
【申請(qǐng)日】2015年2月11日