利用tale轉(zhuǎn)錄抑制子在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中模塊化構(gòu)建合成基因線路的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及利用TALE轉(zhuǎn)錄抑制子在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中模塊化構(gòu)建合成基因線路。
【背景技術(shù)】
[0002] 合成的基因線路經(jīng)過精心設(shè)計(jì)，依據(jù)功能將基因調(diào)控裝置組裝起來，感受、整合、 處理細(xì)胞內(nèi)的分子信息，行使一定的功能。各種合成基因線路已發(fā)展在細(xì)胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)可定制、 可編程的功能，包括動(dòng)態(tài)行為、開關(guān)和記憶、細(xì)胞間通訊、適應(yīng)性、細(xì)胞極化、數(shù)字和模擬計(jì) 算和復(fù)雜的生物合成途徑。這些基因線路中大多數(shù)是通過使用有限的基因元件和昂貴、低 效的"嘗試-錯(cuò)誤"的方法構(gòu)建。因此，為了簡化設(shè)計(jì)和優(yōu)化對活體細(xì)胞進(jìn)行復(fù)雜的操作， 研發(fā)出一個(gè)大規(guī)模的、功能定義良好的合成基因元件庫和相應(yīng)的計(jì)算模型和模擬方法是很 有必要的。
[0003] 在針對哺乳動(dòng)物的合成生物學(xué)研宄領(lǐng)域，工程化的合成轉(zhuǎn)錄激活子和抑制子是 支持可擴(kuò)展的基因線路設(shè)計(jì)的一個(gè)重要的目標(biāo)。目前，構(gòu)建哺乳動(dòng)物/真核生物轉(zhuǎn)錄抑 制子常用的策略是融合一個(gè)轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域和一個(gè)工程化的DNA結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域，比如 鋅指蛋白、轉(zhuǎn)錄激活子類似因子（TALE)蛋白和失活的Cas9(dCas9)核酸酶在RNA引導(dǎo)的 CRISPR(簇狀周期性間隔短回文重復(fù)序列）系統(tǒng)。然而，轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域，如Krilppel相關(guān) 盒（KRAB)轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域和mSin相互作用結(jié)構(gòu)域（SID4)通常會導(dǎo)致靶啟動(dòng)子附近的表 觀遺傳學(xué)修飾，因而響應(yīng)時(shí)間很慢。因此，這種轉(zhuǎn)錄抑制不適用于構(gòu)建響應(yīng)快速、可逆的基 因線路。
[0004] 另一種普遍存在于原核生物中的轉(zhuǎn)錄抑制模式是通過無功能結(jié)構(gòu)域的空間位阻， 而這在真核生物中并不常見，例如，Lac抑制子（LacI)和四環(huán)素抑制子（TetR)通過低聚化 結(jié)合在啟動(dòng)子附近的特異DNA序列，使DNA形成一個(gè)環(huán)，從而阻止轉(zhuǎn)錄起始核心元件在啟動(dòng) 子區(qū)域的結(jié)合）。已有研宄表明，在哺乳動(dòng)物基因調(diào)控的環(huán)境下，在合成基因線路中把LacI 結(jié)合位點(diǎn)放置在巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子（CMV)或者CAG啟動(dòng)子下游，可以抑制基因表達(dá)，雖然抑 制效率在哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)中低于原核表達(dá)系統(tǒng)。類似的，在哺乳動(dòng)物系統(tǒng)中dCas9蛋白 不融合任何轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域也表現(xiàn)出弱的轉(zhuǎn)錄抑制功能。
[0005] TALER蛋白由若干個(gè)特異性識別DNA的串聯(lián)"蛋白模塊"和兩側(cè)的N-末端及C-末 端序列組成。每個(gè)"蛋白模塊"包含33-35個(gè)氨基酸殘基，第12、13位氨基酸殘基是靶向識 別的關(guān)鍵位點(diǎn)，被稱作重復(fù)可變的雙連氨基酸殘基（RVDs)位點(diǎn)。TALER蛋白上的每個(gè)RVD 僅能識別一個(gè)喊基。TALEN(Transcription Activator-Like Effector Nuclease)是一種 人工改造的限制性內(nèi)切酶，是將TALER蛋白（作為DNA結(jié)合域）與限制性內(nèi)切酶Fok I (作 為DNA切割域，又稱抑制結(jié)構(gòu)域）融合而得到的TALEN融合蛋白。TALEN在細(xì)胞中與基因組 的靶位點(diǎn)結(jié)合，形成二聚體發(fā)揮內(nèi)切酶活性，導(dǎo)致左右TALEN的spacer區(qū)域發(fā)生雙鏈DNA 斷裂（DSB，Double-Strand Breaks)，從而誘發(fā)DNA損傷修復(fù)機(jī)制。細(xì)胞可以通過非同源性 末端接合機(jī)制（NHEJ，Non-homologous End Joining)修復(fù)DNA。NHEJ修復(fù)機(jī)制并不精確， 極易發(fā)生錯(cuò)誤（缺失/插入），從而造成移碼突變，因此可以達(dá)到基因敲除的目的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供利用TALE轉(zhuǎn)錄抑制子在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中模塊化構(gòu)建合成基 因線路。
[0007] 本發(fā)明保護(hù)的第一種實(shí)現(xiàn)兩種蛋白可調(diào)控式表達(dá)的方法，包括如下步驟：
[0008] 將所述兩種蛋白分別命名為蛋白甲和蛋白乙；蛋白甲的編碼基因位于表達(dá)盒 甲-I，蛋白乙的編碼基因位于表達(dá)盒乙-I ;
[0009] 所述表達(dá)盒甲-I自上游至下游依次包括如下元件：反饋元件的編碼序列、啟動(dòng) 子甲、通過自剪切多肽的編碼基因連接的蛋白甲的編碼基因和TALER蛋白甲的編碼基因、 靶序列甲-I ;所述靶序列甲-I包括1個(gè)以上（具體可為4個(gè)）shRNAl的靶序列；
[0010] 所述表達(dá)盒乙-I自上游至下游依次包括如下元件：反饋元件的編碼序列、啟動(dòng) 子乙、通過自剪切多肽的編碼基因連接的蛋白乙的編碼基因和TALER蛋白乙的編碼基因、 靶序列乙-I ;所述靶序列乙-I包括1個(gè)以上（具體可為4個(gè)）shRNA2的靶序列；
[0011] 所述表達(dá)盒甲-I中，所述啟動(dòng)子甲的上游和下游各具有至少一個(gè)所述TALER蛋 白乙的靶點(diǎn)，或，所述啟動(dòng)子甲的上游不具有所述TALER蛋白乙的靶點(diǎn)但其下游具有至少 一個(gè)所述TALER蛋白乙的靶點(diǎn)；
[0012] 所述表達(dá)盒乙-I中，所述啟動(dòng)子乙的上游和下游各具有至少一個(gè)所述TALER蛋 白甲的靶點(diǎn)，或，所述啟動(dòng)子乙的上游不具有所述TALER蛋白甲的靶點(diǎn)但其下游具有至少 一個(gè)所述TALER蛋白甲的靶點(diǎn)；
[0013] 所述表達(dá)盒丙自上游至下游依次包括組成型啟動(dòng)子和激活元件的編碼序列；在所 述激活元件的刺激下，位于所述反饋元件的編碼序列的下游的DNA表達(dá)；
[0014] 將具有所述表達(dá)盒甲-I的重組載體甲-I、具有所述表達(dá)盒乙-I的重組載體 乙-I和具有所述表達(dá)盒丙的重組載體丙導(dǎo)入宿主細(xì)胞，通過加入shRNAl或shRNA2調(diào)控 所述蛋白甲的表達(dá)和所述蛋白乙的表達(dá)。
[0015] 所述表達(dá)盒甲-I中，所述啟動(dòng)子甲的上游具有1個(gè)所述TALER蛋白乙的靶點(diǎn)且 其下游具有1-3個(gè)所述TALER蛋白乙的靶點(diǎn)；
[0016] 所述表達(dá)盒乙-I中，所述啟動(dòng)子乙的上游具有1個(gè)所述TALER蛋白甲的靶點(diǎn)且 其下游具有1-3個(gè)所述TALER蛋白甲的靶點(diǎn)。
[0017] 所述表達(dá)盒甲-I中，所述啟動(dòng)子甲上游的TALER蛋白乙的靶點(diǎn)與所述啟動(dòng)子甲 下游最鄰近的TALER蛋白乙的靶點(diǎn)之間的距離為72-100bp ;
[0018] 所述表達(dá)盒乙-I中，所述啟動(dòng)子乙上游的TALER蛋白甲的靶點(diǎn)與所述啟動(dòng)子乙 下游最鄰近的TALER蛋白甲的靶點(diǎn)之間的距離為72-100bp。
[0019] 本發(fā)明保護(hù)的第二種實(shí)現(xiàn)兩種蛋白可調(diào)控式表達(dá)的方法，包括如下步驟：
[0020] 將所述兩種蛋白分別命名為蛋白甲和蛋白乙；蛋白甲的編碼基因位于表達(dá)盒 甲-I，蛋白乙的編碼基因位于表達(dá)盒乙-I ;
[0021] 所述表達(dá)盒甲-I自上游至下游依次包括如下元件：反饋元件的編碼序列、啟動(dòng) 子甲、通過自剪切多肽的編碼基因連接的蛋白甲的編碼基因和TALER蛋白甲的編碼基因、 靶序列甲-I ;所述靶序列甲-I包括shRNAl-Ι的靶序列、……、shRNAl-n的靶序列，η為 2以上的自然數(shù)；
[0022] 所述表達(dá)盒乙-I自上游至下游依次包括如下元件：反饋元件的編碼序列、啟動(dòng) 子乙、通過自剪切多肽的編碼基因連接的蛋白乙的編碼基因和TALER蛋白乙的編碼基因、 靶序列乙-I ;所述靶序列乙-I包括shRNA2-l的靶序列、……、shRNA2-n的靶序列，η為 2以上的自然數(shù)；
[0023] 所述表達(dá)盒甲-I中，所述啟動(dòng)子甲的上游和下游各具有至少一個(gè)所述TALER蛋 白乙的靶點(diǎn)，或，所述啟動(dòng)子甲的上游不具有所述TALER蛋白乙的靶點(diǎn)但其下游具有至少 一個(gè)所述TALER蛋白乙的靶點(diǎn)；
[0024] 所述表達(dá)盒乙-I中，所述啟動(dòng)子乙的上游和下游各具有至少一個(gè)所述TALER蛋 白甲的靶點(diǎn)，或，所述啟動(dòng)子乙的上游不具有所述TALER蛋白甲的靶點(diǎn)但其下游具有至少 一個(gè)所述TALER蛋白甲的靶點(diǎn)；
[0025] 所述表達(dá)盒丙自上游至下游依次包括組成型啟動(dòng)子和激活元件的編碼序列；在所 述激活元件的刺激下，位于所述反饋元件的編碼序列的下游的DNA表達(dá)；
[0026] 將具有所述表達(dá)盒甲-I的重組載體甲-I、具有所述表達(dá)盒乙-I的重組載 體乙-I和具有所述表達(dá)盒丙的重組載體丙導(dǎo)入宿主細(xì)胞，通過加入shRNAl-1、......、 shRNAl-n、shRNA2-l、……或shRNA2_n調(diào)控所述蛋白甲的表達(dá)和所述蛋白乙的表達(dá)。
[0027] 所述表達(dá)盒甲-I中，所述啟動(dòng)子甲的上游具有1個(gè)所述TALER蛋白乙的靶點(diǎn)且 其下游具有1-3個(gè)所述TALER蛋白乙的靶點(diǎn)；
[0028] 所述表達(dá)盒乙-I中，所述啟動(dòng)子乙的上游具有1個(gè)所述TALER蛋白甲的靶點(diǎn)且 其下游具有1-3個(gè)所述TALER蛋白甲的靶點(diǎn)。
[0029] 所述表達(dá)盒甲-I中，所述啟動(dòng)子甲上游的TALER蛋白乙的靶點(diǎn)與所述啟動(dòng)子甲 下游最鄰近的TALER蛋白乙的靶點(diǎn)之間的距離為72-100bp ;
[0030] 所述表達(dá)盒乙-I中，所述啟動(dòng)子乙上游的TALER蛋白甲的靶點(diǎn)與所述啟動(dòng)子乙 下游最鄰近的TALER蛋白甲的靶點(diǎn)之間的距離為72-100bp。
[0031] 本發(fā)明保護(hù)的第三種實(shí)現(xiàn)兩種蛋白可調(diào)控式表達(dá)的方法，包括如下步驟：
[0032] 將所述兩種蛋白分別命名為蛋白甲和蛋白乙；蛋白甲的編碼基因位于表達(dá)盒 甲-I，蛋白乙的編碼基因位于表達(dá)盒乙-I，蛋白乙的編碼基因位于表達(dá)盒丁- I ;
[0033] 所述表達(dá)盒甲-I自上游至下游依次包括如下元件：反饋元件的編碼序列、啟動(dòng) 子甲、通過自剪切多肽的編碼基因連接的蛋白甲的編碼基因和TALER蛋白甲的編碼基因、 靶序列甲-I ;所述靶序列甲-I包括shRNAl-1的靶序列、……、shRNAl-n的靶序列，η為 2以上的自然數(shù)；
[0034] 所述表達(dá)盒乙-I自上游至下游依次包括如下元件：反饋元件的編碼序列、啟動(dòng) 子乙、通過自剪切多肽的編碼基因連接的蛋白乙的編碼基因和TALER蛋白乙的編碼基因、 靶序列乙-I ;所述靶序列乙-I包括shRNA2-l的靶序列、……、shRNA2-n的靶序列，η為 2以上的自然數(shù)；
[0035] 所述表達(dá)盒丁 - I自上游至下游依次包括如下元件：反饋元件的編碼序列、啟動(dòng) 子丁、通過自剪切多肽的編碼基因連接的蛋白乙的編碼基因和TALER蛋白乙的編碼基因、 靶序列?。凰霭行蛄卸?- I包括shRNA3-l的靶序列、……、shRNA3-n的靶序列，η為2以 上的自然數(shù)；
[0036] 所述表達(dá)盒甲-I中，所述啟動(dòng)子甲的上游和下游各具有至少一個(gè)所述TALER蛋 白乙的靶點(diǎn)，或，所述啟動(dòng)子甲的上游不具有所述TALER蛋白乙的靶點(diǎn)但其下游具有至少 一個(gè)所述TALER蛋白乙的靶點(diǎn)；
[0037] 所述表達(dá)盒乙-I中，所述啟動(dòng)子乙的上游和下游各具有至少一個(gè)所述TALER蛋 白甲的靶點(diǎn)，或，所述啟動(dòng)子乙的上游不具有所述TALER蛋白甲的靶點(diǎn)但其下游具有至少 一個(gè)所述TALER蛋白甲的靶點(diǎn)；
[0038] 所述表達(dá)盒丁 - I中，所述啟動(dòng)子丁的上游和下游各具有至少一個(gè)所述TALER蛋 白甲的靶點(diǎn)，或，所述啟動(dòng)子丁的上游不具有所述TALER蛋白甲的靶點(diǎn)但其下游具有至少 一個(gè)所述TALER蛋白甲的靶點(diǎn)；
[0039] 所述表達(dá)盒丙自上游至下游依次包括組成型啟動(dòng)子和激活元件的編碼序列；在所 述激活元件的刺激下，位于所述反饋元件的編碼序列的下游的DNA表達(dá)；
[0040] 將具有所述表達(dá)盒甲-I的重組載體甲-I、具有所述表達(dá)盒乙-I的重組載體 乙-I、具有所述表達(dá)盒丙的重組載體丙和具有所述表達(dá)盒丁- I的重組載體丁- I導(dǎo)入 宿主細(xì)胞，通過加入 shRNAl-1、......、shRNAl-n、shRNA2-l、......、shRNA2-n、shRNA3_l、...... 或shRNA3-n調(diào)控所述蛋白甲的表達(dá)和所述蛋白乙的表達(dá)。
[0041] 所述表達(dá)盒甲-I中，所述啟動(dòng)子甲的上游具有1個(gè)所述TALER蛋白乙的靶點(diǎn)且 其下游具有1-3個(gè)所述TALER蛋白乙的靶點(diǎn)；
[0042] 所述表達(dá)盒乙-I中，所述啟動(dòng)子乙的上游具有1個(gè)所述TALER蛋白甲的靶點(diǎn)且 其下游具有1-3個(gè)所述TALER蛋白甲的靶點(diǎn)；
[0043] 所述表達(dá)盒丁 - I中，所述啟動(dòng)子丁的上游具有1個(gè)所述TALER蛋白甲的靶點(diǎn)且 其下游具有1-3個(gè)所述TALER蛋白甲的靶點(diǎn)。
[0044] 所述表達(dá)盒甲-I中，所述啟動(dòng)子甲上游的TALER蛋白乙的靶點(diǎn)與所述啟動(dòng)子甲 下游最鄰近的TALER蛋白乙的靶點(diǎn)之間的距離為72-100bp ;
[0045] 所述表達(dá)盒乙-I中，所述啟動(dòng)子乙上游的TALER蛋白甲的靶點(diǎn)與所述啟動(dòng)子乙 下游最鄰近的TALER蛋白甲的靶點(diǎn)之間的距離為72-100bp ;
[0046] 所述表達(dá)盒丁 - I中，所述啟動(dòng)子丁上游的TALER蛋白甲的靶點(diǎn)與所述啟動(dòng)子丁 下游最鄰近的TALER蛋白甲的靶點(diǎn)之間的距離為72-100bp。
[0047] 本發(fā)明保護(hù)的第一種從混合細(xì)胞中分選細(xì)胞甲和/或細(xì)胞乙的方法，包括如下步 驟；
[0048] 所述細(xì)胞甲具有特定miRNAl ;所述細(xì)胞乙具有特定miRNA2 ;
[0049] 將具有表達(dá)盒甲-II的重組載體甲-II、具有表達(dá)盒乙-II的重組載體乙-II和 具有表達(dá)盒丙的重組載體丙導(dǎo)入所述混合細(xì)胞，通過檢測熒光蛋白甲和/或熒光蛋白乙的 強(qiáng)度分選所述細(xì)胞甲和/或所述細(xì)胞乙；所述熒光蛋白甲和所述熒光蛋白乙具有不同的熒 光顏色；
[0050] 所述表達(dá)盒甲-II自上游至下游依次包括如下元件：反饋元件的編碼序列、啟動(dòng) 子甲、通過自剪切多肽的編碼基因連接的所述熒光蛋白甲的編碼基因和TALER蛋白甲的編 碼基因、靶序列甲-II ;所述靶序列甲-II包括1個(gè)以上（具體可為4個(gè)）miRNAl的靶序 列；
[0051] 所述表達(dá)盒乙-II自上游至下游依次包括如下元件：反饋元件的編碼序列、啟動(dòng) 子乙、通過自剪切多肽的編碼基因連接的所述熒光蛋白乙的編碼基因和TALER蛋白乙的編 碼基因、靶序列乙-II ;所述靶序列乙-II包括1個(gè)以上（具體可為4個(gè)）miRNA2的靶序 列；
[0052] 所述表達(dá)盒甲-II中，所述啟動(dòng)子甲的上游和下游各具有至少一個(gè)所述TALER蛋 白乙的靶點(diǎn)，或，所述啟動(dòng)子甲的上游不具有所述TALER蛋白乙的靶點(diǎn)但其下游具有至少 一個(gè)所述TALER蛋白乙的靶點(diǎn)；
[0053] 所述表達(dá)盒乙-II中，所述啟動(dòng)子乙的上游和下游各具有至少一個(gè)所述TALER蛋 白甲的靶點(diǎn)，或，所述啟動(dòng)子乙的上游不具有所述TALER蛋白甲的靶點(diǎn)但其下游具有至少 一個(gè)所述TALER蛋白甲的靶點(diǎn)；
[0054] 所