一種視皮層神經(jīng)元體外培養(yǎng)方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及細胞工程領域，具體涉及一種視皮層神經(jīng)元體外培養(yǎng)方法。
【背景技術】
[0002] 初級視皮層（br〇dmmanl7區(qū)），位于大腦半球枕后部靠近小腦區(qū)域，是視覺高級中 樞的重要組成部分。出生后人類和哺乳動物的視覺神經(jīng)系統(tǒng)能依據(jù)視覺環(huán)境改變其原有神 經(jīng)聯(lián)系和突觸結構，這一改變發(fā)生的最敏感時期被稱為視皮層可塑性關鍵期，在人類此時 期為出生后2-10歲，大鼠為出生后2-6周。期間異常的視覺經(jīng)驗將會引起視力下降，但眼 部無器質性病變，即眼科臨床常見的弱視。其病變部位主要在視皮層，與視皮層可塑性關系 密切。視皮層可塑性關鍵期內，給予有效的視覺刺激，弱視可以治愈；關鍵期終止后，視皮層 可塑性被抑制，此時異常的視覺環(huán)境將不再引起弱視，但已形成的弱視亦難以恢復，這也是 10歲以上兒童及成年人弱視難以治愈的原因。為揭示弱視的發(fā)病機制和尋找成年弱視治療 途徑，視皮層可塑性及其關鍵期的終止機制成為了目前研宄的切入點。
[0003] 目前對視皮層可塑性的研宄多建立在動物活體和腦片水平上，常局限在神經(jīng)環(huán)路 上，難以深入研宄神經(jīng)元本身，而鑒于視皮層可塑性在神經(jīng)元層面上表現(xiàn)為神經(jīng)元的突觸 可塑性，因此對視皮層突觸可塑性的研宄成為了深入研宄視皮層可塑性的切入點。同時因 急性分離的神經(jīng)元喪失完整的突起分枝，表面受體被部分破壞或丟失，胞間無法形成聯(lián)系， 不利于突觸可塑性的研宄，所以目前突觸可塑性的研宄主要建立在神經(jīng)元細胞的培養(yǎng)水平 上?；诖?，建立一個適用于視皮層神經(jīng)元突觸可塑性研宄的神經(jīng)元培養(yǎng)體系對深入研宄 視皮層可塑性是非常必要的，同時該體系在眼科病理及藥物反應和弱視發(fā)病、治療機制等 研宄領域亦可發(fā)揮作用。而這樣的培養(yǎng)體系在國內尚未見報道，國外類似研宄體系多建立 在海馬上，尚未見報道建立用于視皮層神經(jīng)元突觸可塑性研宄的神經(jīng)元體外培養(yǎng)體系。
[0004] 同時，目前對視皮層可塑性關鍵期終止機制的研宄認為，GABA能抑制性中間神經(jīng) 元的成熟和神經(jīng)元周圍網(wǎng)絡（Perineuronal nets，PNs)的表達增多對視皮層可塑性關鍵期 終止有明顯促進作用：關鍵期后期，神經(jīng)元周圍網(wǎng)絡PNs表達增多且由可溶復合物轉變?yōu)?不可溶復合物，固化神經(jīng)元突觸結構，并包繞在GABA神經(jīng)元周圍促進其成熟；GABA神經(jīng)元 成熟后進一步抑制突觸可塑性，和PNs共同參與可塑性關鍵期的終止。
[0005] LE大鼠，全名為long evans大鼠，因其眼部結構和人類較似，常被作為大鼠眼科 實驗研宄對象，因此本實驗采用LE大鼠為研宄對象。培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，與出生后l-3d新生鼠相比， 采用胎鼠獲得的神經(jīng)元純度高，雜細胞少，膠質細胞分裂能力低；采用孕19-21d的胎鼠， 其膠質細胞分裂能力較強，小于孕Hd的胎鼠，其大腦視皮層區(qū)域生長尚未成熟，定位較困 難，且神經(jīng)元較為脆弱，培養(yǎng)后期易凋亡。實驗發(fā)現(xiàn)，孕17-18d胎鼠培養(yǎng)的視皮層神經(jīng)元純 度較高（80-90% )，活性較好，存活率高且存活時間長。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明運用B27搭配無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)視皮層神經(jīng)元，并對神經(jīng)元的純度、生長 狀態(tài)進行鑒定，同時對與關鍵期終止機制相關的GABA能抑制性中間神經(jīng)元（GAD 65/67標 記）和PNs陽性細胞（Neurocan標記）進行免疫熒光檢測，及采用膜片鉗技術檢測神經(jīng)元 的功能發(fā)育狀況，率先研發(fā)出用于視皮層神經(jīng)元突觸可塑性研宄的神經(jīng)元體外培養(yǎng)方法。 [0007] 本發(fā)明的技術方案如下：
[0008] 用于視皮層神經(jīng)元突觸可塑性研宄的神經(jīng)元體外培養(yǎng)方法，其特征在于，包括如 下步驟：
[0009] 1)取胎鼠大腦組織進行預處理，分離視皮層組織并進行蛋白酶消化，離心；
[0010] 2)加入接種培養(yǎng)基終止消化；
[0011] 3)吹打成單細胞懸液后過篩并計數(shù)；
[0012] 4)以2. 5X 104-5X 104個/cm2的密度用接種培養(yǎng)基進行接種，進行全換液方式的 貼壁培養(yǎng)；細胞貼壁后，進行半換液方式的后續(xù)培養(yǎng)。
[0013] 所述胎鼠為孕17-18天的雌性大鼠的胎鼠；所述預處理指將所述大鼠大腦組織浸 泡在血清高糖解剖液里10分鐘；所述分離視皮層組織在普通解剖液中進行。
[0014] 所述血清高糖解剖液指DMEM/F12培養(yǎng)基中加入體積比為10 %的馬血清和 2X 105U/L的青鏈霉素；所述普通解剖液為Earle's平衡鹽溶液中加入2X 105U/L的青鏈 霉素和體積比為1%的4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液。
[0015] 所述吹打指，用口徑分別為2 μπκ?. 5 μπι、0. 8 μπι的巴氏管依次對組織進行輕柔 吹打，且用每種巴氏管吹打5-6次。
[0016] 所述蛋白酶消化指取視皮層組織在解剖顯微鏡下剪成ImmX Imm小塊，然后用 37°C預熱0. 5小時的14U/ml的木瓜蛋白酶在37°C水浴中消化15-20分鐘；所述離心是指 在1500r/min的轉速下離心3分鐘。
[0017] 所述全換液方式的貼壁培養(yǎng)指：接種2h后觀察，若細胞碎片較多，應在接種6h后 以接種培養(yǎng)基進行全換液，18h后用維持培養(yǎng)基全換液；如碎片較少，則24h后用維持培養(yǎng) 基進行全換液；所述半換液方式的后續(xù)培養(yǎng)指用維持培養(yǎng)基2-3天進行一次半換液的方式 進行培養(yǎng)。
[0018] 所述維持培養(yǎng)基指Neurobasal? Medium無血清培養(yǎng)基中加入體積比為2%的B27 血清替代物和2X 105U/L的青鏈霉素以及0. 5mmol/L的L-谷氨酰氨。
[0019] 所述接種培養(yǎng)基為DMEM/F12培養(yǎng)基中加入體積比為10%的馬血清、2X 105U/L的 青鏈霉素和〇. 5mmol/L的L-谷氨酰氨。
[0020] 所述神經(jīng)元體外培養(yǎng)方法獲得的大鼠視皮層神經(jīng)元細胞系。
[0021] 所述神經(jīng)元體外培養(yǎng)方法在視皮層神經(jīng)元突觸可塑性研宄方面的應用。
[0022] 本發(fā)明所述的大鼠視皮層神經(jīng)元培養(yǎng)方法有諸多改進之處。首先，本發(fā)明經(jīng)培養(yǎng) 發(fā)現(xiàn)，與出生后l-3d新生鼠相比，采用胎鼠獲得的神經(jīng)元純度高，雜細胞少，膠質細胞分裂 能力低；采用孕19-21d的胎鼠，其膠質細胞分裂能力較強，小于孕14d的胎鼠，其大腦視 皮層區(qū)域生長尚未成熟，定位較困難，且神經(jīng)元較為脆弱，培養(yǎng)后期易凋亡。實驗發(fā)現(xiàn)，孕 17-18d胎鼠培養(yǎng)的視皮層神經(jīng)元純度較高（80-90% )，活性較好，存活率高且存活時間長， 因此本發(fā)明創(chuàng)新采用孕17-18d雌性大鼠的胎鼠作為取材對象。其次，為維持神經(jīng)元正常代 謝，減少神經(jīng)元損傷，本發(fā)明所述的培養(yǎng)方法將所述胎鼠的大腦組織浸泡在血清高糖解剖 液里，使得取材至接種完成耗時縮短在2h內；此外，為減少可分裂雜細胞（如血管內皮細 胞等）的存在，盡可能將軟腦膜剝除干凈；消化過程中，為保證組織消化完全，消化前所取 視皮層組織先在解剖顯微鏡下剪成ImmX Imm小塊，且木瓜蛋白酶亦先在37°C預熱0. 5h進 行預激活；吹打過程中，為避免神經(jīng)元細胞過度損傷和刺激膠質細胞分裂，吹打動作盡量輕 柔，吹打次數(shù)不宜過多；關于接種密度，本發(fā)明研宄發(fā)現(xiàn)接種密度大于50*104個/cm2時，細 胞間空間資源不夠，培養(yǎng)大于IOd細胞形態(tài)異常，不利于電生理和形態(tài)學研宄，而密度小于 1*104個/cm2,則神經(jīng)元間相互連接減少，難以彼此供應營養(yǎng)，影響后期生長；反復實驗后， 建議接種密度在2. 5-5*104個/cm2較為合適；培養(yǎng)基上，雖有研宄通過在含血清培養(yǎng)基內 加入阿糖胞苷以抑制膠質細胞分裂生長，然而阿糖胞苷對神經(jīng)元也有一定毒性作用[14]， 因此本方法先采用含血清培養(yǎng)基助神經(jīng)元貼壁和生長，待接種24h神經(jīng)元基本貼壁后，換 為含B27的無血清培養(yǎng)基[16]，以抑制膠質細胞分裂生長，同時促進神經(jīng)元生長；后續(xù)培養(yǎng) 為保證神經(jīng)元可使用自身分泌的生長因子以及避免對培養(yǎng)環(huán)境（滲透壓、pH等）造成劇烈 改變，采取2-3天半換液原則換液；需要長期培養(yǎng)（培養(yǎng)超過20d)時，培養(yǎng)后期（培養(yǎng)15d 后）換液次數(shù)可逐漸減少至7天半換液一次，以保證神經(jīng)元培養(yǎng)環(huán)境的穩(wěn)定。用以上方法 培養(yǎng)出來的神經(jīng)元，其存活率高、生長狀態(tài)良好，純度達80% -90%。
[0023] 本發(fā)明分別采用GAD65/67和Neurocan對GABA神經(jīng)元和PNs進行標記，結果表明 本法獲得的視皮層神經(jīng)元上Neurocan和GAD65/67的表達均呈陽性，PNs陽性細胞比例一 直維持在80% -85%，GABA陽性神經(jīng)元比例一直維持在40% -45%。