一種番茄內(nèi)生真菌交織枝頂孢及其在番茄根結(jié)線蟲病生防中的應(yīng)用
【專利說明】一種番茄內(nèi)生真菌交織枝頂孢及其在番茄根結(jié)線蟲病生防 中的應(yīng)用 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生物防治技術(shù)領(lǐng)域，具體的說，本發(fā)明涉及一種交織枝頂孢菌及其在 番茄根結(jié)線蟲病生防中的應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 番茄根結(jié)線蟲病是一種嚴重危害番茄品質(zhì)和產(chǎn)量的土傳性病害。根結(jié)線蟲主要侵 染番茄根部，尤其側(cè)根受害多。根上形成很多近球狀瘤狀物，似念珠狀相互連接，初表面白 色，后變褐色或黑色，地上部表現(xiàn)萎縮或黃化。線蟲以成蟲或卵在病組織里或以幼蟲在土壤 中越冬。病土和病肥是發(fā)病主要來源。該線蟲發(fā)育適溫25-3CTC，幼蟲遇低溫失去活動能 力，48-60°C經(jīng)5分鐘致死，在土中存活一年，2年即全部死亡。番茄根部被破壞，影響正常的 吸收機能，所以地上部生長發(fā)育受阻，輕者癥狀不明顯，重者生長緩慢，植株比較矮小，生育 不良，結(jié)果小而且少。在中午氣溫較高時，地上部植株呈萎蔫狀態(tài)；早晚氣溫較低或澆水充 足時，暫時萎蔫又可恢復(fù)正常。隨著病情的發(fā)展，植株逐漸枯死。
[0003] 根結(jié)線蟲防治以化學(xué)防治為主，不僅破壞土壤生態(tài)環(huán)境，還對人體健康造成影 響?；瘜W(xué)防治帶來的環(huán)境污染和農(nóng)藥殘留問題嚴重制約我國番茄產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，生物防治 具有環(huán)境相容性、綠色環(huán)保性特點，具有廣闊的應(yīng)用前景。近年來，番茄根結(jié)線蟲生防 菌的篩選受到關(guān)注。人們分離到多種根結(jié)線蟲生防菌，如厚垣孢普可尼亞菌（Pochonia chlamydosporia)、尖抱枝抱(Cladosporiumoxysporum)、淡紫擬青霉(Paecilomyces lilacinus)和綠色木霉（Trichodermaviride)等。這些生防菌通過寄生線蟲或卵塊、分泌 殺線蟲活性物質(zhì)來抑制根結(jié)線蟲，但在田防效不佳，主要由于這些生防菌不能在土壤中定 殖。植物內(nèi)生真菌可產(chǎn)生殺線蟲活性的次生代謝產(chǎn)物直接作用于線蟲。內(nèi)生真菌能定殖于 植物體內(nèi)，在與其他土壤微生物競爭中具有優(yōu)勢，能夠以"守株待兔"的方式防治線蟲，具有 靶向性，極具開發(fā)潛力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對現(xiàn)有根結(jié)線蟲生物防治技術(shù)未有良好生防菌的現(xiàn)狀，本發(fā)明旨在提供一種番 茄內(nèi)生真菌交織枝頂孢及其作為番茄根結(jié)線蟲生防菌的應(yīng)用。通過試驗驗證，采用本發(fā)明 提供的交織枝頂孢對防治番茄根結(jié)線蟲具有良好效果。這對于進一步減少農(nóng)藥用量，提高 番茄品質(zhì)，促進我國的番茄產(chǎn)業(yè)向著綠色無公害方向發(fā)展具有重要意義。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案：通過從多年種植番茄大棚內(nèi)感染根結(jié)線蟲的番茄根結(jié)中分離 內(nèi)生真菌，獲得較強抑制根結(jié)線蟲活性的菌株，經(jīng)過進一步篩選，獲得一株編號為TEF。通過 對菌株進行形態(tài)特征和18SrDNA序列測定及系統(tǒng)發(fā)育分析，初步確定了其分離地位；同時 對該菌株的發(fā)酵液對根結(jié)線蟲二齡幼蟲致死率，菌株孢子懸浮液對番茄根結(jié)數(shù)量、土壤中 根結(jié)線蟲蟲口數(shù)量以及田間防效等進行了全面系統(tǒng)研究，為番茄根結(jié)線蟲的生物防治提 供了新選擇，其拮抗作用對于番茄根結(jié)線蟲的解決具有突出的技術(shù)效果。
[0006] 本發(fā)明提供的一種作為番爺根結(jié)線蟲生防菌的交織枝頂孢（Acremonium implicatum)。通過在北京順義地區(qū)種植番茄的大棚內(nèi)番茄根結(jié)中分離、篩選和培養(yǎng)，獲得 一批作為番爺根結(jié)線蟲拮抗菌的微生物菌株。從中篩選出一株編號為TEF的菌株，對于番 茄根結(jié)線蟲具有穩(wěn)定而顯著的拮抗效果，經(jīng)微生物學(xué)分類與鑒定，屬于交織枝頂孢菌。
[0007] 具體的，本發(fā)明提供的一種作為番茄根結(jié)線蟲生防菌交織枝頂孢，命名為TEF。該 菌株已于申請日前保藏于約布達佩斯條微生物國際保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委 員會普通微生物中心。地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究 所，郵編：100101。保藏日期2013. 10. 9,保藏號是CGMCCN0. 8300。經(jīng)微生物學(xué)鑒定為交織 枝頂孢。該菌株最適生長條件為：溫度25°C，培養(yǎng)基（PDA)為馬鈴薯粉0.6% (w/v)，葡萄 糖1.5-2%(?八)，瓊脂1.5-2%(￥八)，口117.0-7.2，1211：滅菌20分鐘。在？0六培養(yǎng)基平板 上，25°C，培養(yǎng)7天后，菌株TEF菌落直徑為18-25mm，菌絲白色，菌落中央產(chǎn)生氣生菌絲，瓶 梗長度5-10ym，基部寬1. 5?2. 0ym，頂部寬0? 5?1ym。分生孢子串生于瓶梗上，形成 長鏈。分生孢子單胞，橢圓，平滑，大小4. 4?5. 2X1. 4?2.Oilm。未見厚垣孢子。依照 《真菌鑒定手冊》對菌株TEF形態(tài)進行測定，確定該菌株為枝頂孢屬（Acremonium)成員。通 過BLAST同源比對，TEF菌株的 18SrDNA序列與Acremoniumimplicatum的 18SrDNA序 列相似性最高，因此將TEF菌株確定為交織枝頂孢（Acremoniumimplicatum)。
[0008] 進一步，本發(fā)明一種交織枝頂孢（Acremoniumimplicatum)作為番爺根結(jié)線蟲生 防菌的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明進一步提供了菌種的保存條件，采用培養(yǎng)基（PDA)成分：馬鈴薯粉0.6% (w/v)，葡萄糖 1.5-2% (w/v)，瓊脂 1.5-2% ^八），口117.0-7.2，1211：滅菌20分鐘。在？0八 培養(yǎng)基斜面上25°C條件下，培養(yǎng)3天，采用10%滅菌甘油作為保護劑，真空冷凍干燥后低溫 保存；平時使用保存在PDA培養(yǎng)基斜面上，4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0010] 通過實施本發(fā)明具體的
【發(fā)明內(nèi)容】
，可以達到以下有益效果：本發(fā)明提供的交織枝 頂孢（Acremoniumimplicatum)是一種根結(jié)線蟲生防菌，在番爺根結(jié)線蟲防治方面有較高 的應(yīng)用價值，尤其是該菌是番茄內(nèi)生菌，能夠持續(xù)對根結(jié)線蟲起作用，克服了一般生防菌不 能在土壤中定殖而造成防效低的缺陷，所以防治效果較好。
【附圖說明】
[0011] 圖1所示為交織枝頂孢（Acremoniumimplicatum)Tef的菌落形態(tài)圖。圖中，A:菌 落形態(tài)，B:瓶梗C:分生孢子，D:分生孢子串生。
[0012] 圖2所不為交織枝頂抱（Acremoniumimplicatum)Tef的18SrDNA片段PCR擴增 結(jié)果圖，圖中，M指標(biāo)準DNA序列片段大小。
[0013] 圖3所不為交織枝頂抱（Acremoniumimplicatum)Tef的18SrDNA系統(tǒng)發(fā)育樹圖。 圖中，Tef指交織枝頂抱（Acremoniumimplicatum)Tef菌株。
[0014] 圖4所示為交織枝頂孢（Acremoniumimplicatum)Tef對根結(jié)線蟲抑制的盆栽效 果圖。圖中，A為對照，B為交織枝頂孢菌液處理。
【具體實施方式】
[0015] 下面，舉實施例說明本發(fā)明，但是，本發(fā)明并不局限于下述的實施例。
[0016]本發(fā)明中涉及到的主要原輔材料、試劑盒儀器設(shè)備：供試南方根結(jié)線蟲 (Meloidogyneincongnita)由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花舟研究所病害組提供；番爺樣品采自 北京市順義區(qū)楊鎮(zhèn)蔬菜基地，取番茄根結(jié)后，在實驗室進行表面消毒，然后分離根結(jié)內(nèi)生真 菌。分離采用馬鈴薯葡糖培養(yǎng)基（PDA) ;MSSPx-250生化培養(yǎng)箱，MLS-3020高壓蒸汽滅菌鍋， 單人雙面凈化工作臺，PCR儀Eppendorf，AllegraX-15R臺式冷凍離心機，電泳儀Bio-Rad Mode，凝膠成像儀United-BioGK-330C，真菌基因組DNA提取試劑盒（杭州博日科技有限公 司），Sigma-Aldrich公司的ReadyMix?TaqPCRReactionMix(含有MgCl2)，其余試劑為 分析純。
[0017] 本發(fā)明中選用的所有原輔材料、試劑盒儀器都為本領(lǐng)域熟知的，其他本領(lǐng)域熟知 的一些試劑盒設(shè)備都可適用于本發(fā)明以下實施方式的實施。
[0018]實施例一：交織枝頂孢（Acremoniumimplicatum)的分離、篩選及鑒定 [0019] (1)拮抗菌的分離和篩選
[0020] 根結(jié)內(nèi)生真菌分離：取番茄根結(jié)組織，用自來水沖洗掉根結(jié)表面泥土，然后用無菌 水沖洗3次，75%酒精浸泡1分鐘，無菌水沖洗3次。用無菌剪刀將根結(jié)剪成0.5X0. 5cm小塊，置于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)。PDA培養(yǎng)基中含有75yg/mL氨芐青霉素，抑制細菌生長。將 培養(yǎng)基置于25°C培養(yǎng)，待根結(jié)小塊長出菌落后，分別挑取菌落邊緣菌絲到另一PDA平板上， 純化。最后將純化的菌株保存?zhèn)溆谩?br>[0021] 菌株發(fā)酵液對根結(jié)線蟲致死活性測定：將菌株接種于含有馬鈴薯葡糖培養(yǎng)液的三 角瓶中，25°C，震蕩培養(yǎng)7天。將發(fā)酵液800rmp/min離心2分鐘，去除菌絲和孢子，再經(jīng)細 菌過濾器過濾，得到無菌的發(fā)酵液。取根結(jié)線蟲2齡幼蟲蟲懸液lml(約含有500頭線蟲） 加入到4ml發(fā)酵液中，25°C靜置48小時后，將線蟲轉(zhuǎn)移至無菌水中復(fù)蘇2小時，身體僵直不 活動的線蟲為死亡線蟲。統(tǒng)計線蟲總數(shù)量和死亡線蟲數(shù)量。馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基作為 對照。計算測試菌株對根結(jié)線蟲的致死率，篩選致死率高的菌株進行后續(xù)試驗。
[0022] 根結(jié)線蟲致死率公式：
【主權(quán)項】
1. 一種從番茄根結(jié)中分離的，可作為番茄根結(jié)線蟲生防菌菌株TEF，為交織枝頂孢 (Acremonium implicatum)，2013年10月9日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通 微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院，中國科學(xué)院微生物研究所，菌種保藏編號 為 CGMCC NO. 8300。 2?如權(quán)利要求1所述的交織枝頂抱（Acremonium implicatum)CGMCC NO. 8300在作為 番茄根結(jié)線蟲生防菌的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求2所述的交織枝頂孢在防治番茄根結(jié)線蟲的使用方法，其特征在于： 1) 將交織枝頂孢接種于含有馬鈴薯葡糖培養(yǎng)液的三角瓶中，25°C，震蕩培養(yǎng)7天。 2) 用無菌紗布過濾掉菌絲，留下孢子，用無菌水將孢子配置成孢子懸浮液，濃度為 lX106CFU/ml。 3) 將孢子懸浮液用滅菌草炭進行吸附，制備成菌劑，比例為1000g草炭吸附500ml孢子 懸浮液。 4) 田間施用菌劑采用溝施或穴施，使用量為每壟1000g，壟長10m，壟寬0.6m，種植20 棵番爺植株。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種番茄內(nèi)生真菌交織枝頂孢(Acremonium implicatum)CGMCC NO.8300及其作為番茄根結(jié)線蟲生防菌的應(yīng)用，屬于生物防治領(lǐng)域。該菌株的發(fā)酵液對根結(jié)線蟲二齡幼蟲具有良好的致死活性。菌株孢子懸浮液(濃度為1×106CFU/ml)用滅菌草炭吸附后作為菌劑，比例為1000g草炭吸附500ml孢子懸浮液。移栽番茄前，菌劑溝施或穴施于種植穴。菌劑對番茄根結(jié)線蟲具有較高的田間防效，達到72.8％。該菌株對于解決番茄根結(jié)線蟲生物防治具有突出的技術(shù)效果，具有廣泛的應(yīng)用領(lǐng)域。CGMCC NO830020131009
【IPC分類】A01N63-04, C12N1-14, A01P5-00, C12R1-645
【公開號】CN104593266
【申請?zhí)枴緾N201310533051
【發(fā)明人】謝丙炎, 田雪亮, 姚玉榮, 陳國華, 茆振川
【申請人】中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所, 河南科技學(xué)院
【公開日】2015年5月6日
【申請日】2013年11月4日