檢測(cè)vkorc1基因突變的引物以及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及檢測(cè)基因突變的引物以及檢測(cè)方法，尤其涉及檢測(cè)VKORCl基因突變 的引物以及應(yīng)用該引物檢測(cè)VKORCl基因突變的方法，屬于VKORCl基因突變的檢測(cè)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] VKORCl基因位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性的參考序列編號(hào)為rs9923231，此序列（aagacct gaaaaacaaccattggccgggtgcggtggctcacgcctataatc)中的第 26 個(gè)堿基為 g 是需要檢測(cè)堿 基，該位置堿基通?？赡芡蛔冎苯佑绊慥KORCl基因（序列號(hào)為AY587020. 1)編碼的維生素 K環(huán)氧化物還原酶的功能。該酶參與抗凝藥華法林代謝。研宄確定個(gè)人華法林弱代謝者與 該基因多態(tài)性相關(guān)。
[0003] 檢測(cè)基因突變的方法有多種，如限制性內(nèi)切酶法、實(shí)時(shí)熒光定量法和新一代測(cè)序 法等，它們最大的缺點(diǎn)是假陰性和假陽(yáng)性的出現(xiàn)，很難分辨。目前主要常用的方法為限制性 內(nèi)切酶法。
[0004] 限制性內(nèi)切酶檢測(cè)VKORCl基因突變位點(diǎn)的主要方法如下：
[0005] 1、提取血液標(biāo)本基因組DNA備用。
[0006] 2、設(shè)計(jì)限制性內(nèi)切酶法檢測(cè)VKORCl基因突變位點(diǎn)的特異性引物，PCR擴(kuò)增需要檢 測(cè)的基因片段。
[0007] 3、常規(guī)純化沉淀PCR擴(kuò)增片段并用合適量的蒸餾水溶解。
[0008] 4、用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶在酶切體系中酶切PCR擴(kuò)增VKORCl基因片段。
[0009] 5、電泳分析PCR擴(kuò)增VKORCl基因片段酶切后DNA條帶的大小與數(shù)量，進(jìn)而判斷 VKORCl基因突變位點(diǎn)基因型。
[0010] 采用限制性內(nèi)切酶法檢測(cè)VKORCl基因所存在的主要缺點(diǎn)如下：
[0011] 1、設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶法酶切受酶本身的純度、DNA的質(zhì)量（主要是純度）、酶切 體系的緩沖液的PH值和離子強(qiáng)度、酶切的溫度和時(shí)間等的影響，通常可能會(huì)出現(xiàn)的問(wèn)題： DNA完全沒(méi)有或不完全被內(nèi)切酶切割；切割的片段數(shù)目多于理論值；酶切后沒(méi)觀察DNA片段 的存在和電泳后DNA片段帶型彌散，不均一等。
[0012] 2、PCR擴(kuò)增片段酶切后DNA凝膠電泳受瓊脂糖的質(zhì)量、凝膠制備、電泳緩沖液的PH 值和離子強(qiáng)度、DNA樣品加入量和DNA樣品中鹽濃度可改變DNA電泳的迀移率等的影響，通 常可能會(huì)出現(xiàn)的問(wèn)題：DNA帶模糊；不規(guī)則DNA帶迀移；帶弱或無(wú) DNA電泳條帶和DNA缺失 等。
[0013] 新一代測(cè)序方法雖然有簡(jiǎn)單、快速和高通量的特點(diǎn)，但致命的弱點(diǎn)是誤讀率高，對(duì) 臨床診斷要求的關(guān)鍵點(diǎn)高準(zhǔn)確不相符。因此，提供一種準(zhǔn)確性高的檢測(cè)樣品中VKORCl 基因的突變位點(diǎn)的方法具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014] 本發(fā)明的目的之一提供一對(duì)特異性的用于檢測(cè)樣品中VKORCl基因突變的引物 對(duì)。
[0015] 本發(fā)明的目的之二是應(yīng)用所述的引物對(duì)檢測(cè)樣品中的VKORCl基因突變的方法。
[0016] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：
[0017] 本發(fā)明首先公開(kāi)了一種用于檢測(cè)VKORCl基因突變的引物對(duì)，其核苷酸序列分別 為 SEQ ID No. 1 和 SEQ ID No. 2 所示。
[0018] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種應(yīng)用所述的引物對(duì)檢測(cè)VKORCl基因是否突變的方法， 包括以下步驟：
[0019] (1)提取待檢測(cè)的血液標(biāo)本中的基因組DNA ;
[0020] (2)以步驟⑴所提取的基因組DNA為模板，以SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2為上 下游引物建立PCR擴(kuò)增體系并進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0021] (3)回收并純化所擴(kuò)增的PCR擴(kuò)增片段；采用Sanger法測(cè)定所純化的PCR擴(kuò)增片 段序列，得到樣本測(cè)序序列；
[0022] (4)用VKORCl基因標(biāo)準(zhǔn)序列與樣本測(cè)序序列比對(duì)，判斷標(biāo)準(zhǔn)序列中界定的檢測(cè)位 點(diǎn)堿基與測(cè)序序列對(duì)應(yīng)位點(diǎn)堿基，分析VKORCl基因突變位點(diǎn)型別。
[0023] 其中，步驟（2)中所述的PCR擴(kuò)增體系如下：
[0024] 2XEx Taq Buffer 10μ1，dNTP(2mM)4yl ;10μΜ 的上游引物（SEQ ID No·l)0·4μl，10μM的下游引物（SEQIDNo·2)0·4μl，ExTaq0·4μl，DNA模板l·5μl，雙 蒸水3. 3 μ 1。
[0025] 步驟（2)中所述的PCR擴(kuò)增程序優(yōu)選為：95°C 5分鐘；94°C、10秒，59°C、20秒， 72 °C、60秒，擴(kuò)增45個(gè)循環(huán)；72 °C，5分鐘。
[0026] 步驟（3)中優(yōu)選用Exo I和CIP酶混合體系純化PCR擴(kuò)增片段。
[0027] 步驟（4)中所述VKORCl基因標(biāo)準(zhǔn)序列為SEQ ID No. 3所示，標(biāo)準(zhǔn)序列中界定的檢 測(cè)位點(diǎn)堿基為SEQ ID No. 3所示的第26個(gè)堿基g。
[0028] 本發(fā)明通過(guò)Sanger法測(cè)序?qū)U(kuò)增出目的DNA片段進(jìn)行測(cè)序，通過(guò)經(jīng)典而又規(guī)范的 操作程序，完全避免了現(xiàn)有的限制性內(nèi)切酶法的缺點(diǎn)，并且直接獲得PCR擴(kuò)增序列的結(jié)果， 將測(cè)序結(jié)果與VK0RC1基因的標(biāo)準(zhǔn)序列比對(duì)，直觀的讀出檢測(cè)堿基的突變，具有非常高的準(zhǔn) 確率。
【附圖說(shuō)明】
[0029] 圖1、PCR擴(kuò)增VK0RC1基因片段電泳圖。
[0030] 圖2、PCR擴(kuò)增VK0RC1基因片段測(cè)序圖。
[0031] 圖3、標(biāo)準(zhǔn)序列與PCR擴(kuò)增VK0RC1基因序列比對(duì)分析。
【具體實(shí)施方式】
[0032] 下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而 更為清楚。但是應(yīng)理解所述實(shí)施例僅是范例性的，不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng) 域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié) 和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0033] 1、樣本要求EDTA或ACD抗凝全血；最佳量5. 0ml，最少量2ml無(wú)菌和無(wú) RNase的 真空采血管或試管；O-KTC冷藏運(yùn)輸小于2天，拒收重度溶血樣本及肝素抗凝的全血。
[0034] 2、全血DNA提取采用DNA提取試劑盒；3ml DNA當(dāng)天不用，-20 °C保存。
[0035] 3、PCR反應(yīng)液體系
[0036] 表IPCR反應(yīng)液體系
[0037]
[0038] VKORCl-F: 5 ' -GTTCCCAGAAGGGTAGGTGC-37
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 用于檢測(cè)VKORCl基因突變的引物對(duì)，其特征在于：其核苷酸序列分別為SEQ ID No. 1 和 SEQ ID No. 2 所示。
2. 權(quán)利要求1所述的引物對(duì)在制備檢測(cè)VKORCl基因突變的診斷試劑或藥物中的用途。
3. 應(yīng)用權(quán)利要求1所述的引物對(duì)檢測(cè)VKORCl基因是否突變的方法，其特征在于，包括 以下步驟： (1) 提取待檢測(cè)的血液標(biāo)本中的基因組DNA ; (2) 以步驟（1)所提取的基因組DNA為模板，以SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2為上下游 引物建立PCR擴(kuò)增體系并進(jìn)行PCR擴(kuò)增； (3) 回收并純化所擴(kuò)增的PCR擴(kuò)增片段；采用Sanger法測(cè)定所純化的PCR擴(kuò)增片段序 列，得到樣本測(cè)序序列； (4) 用VKORCl基因標(biāo)準(zhǔn)序列與樣本測(cè)序序列比對(duì)，判斷標(biāo)準(zhǔn)序列中界定的檢測(cè)位點(diǎn)堿 基與測(cè)序序列對(duì)應(yīng)位點(diǎn)堿基，分析VKORCl基因突變位點(diǎn)型別。
4. 按照權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于：步驟（2)中所述的PCR擴(kuò)增體系如下： 2XEx Taq Buffer 10μ1，（1ΝΤΡ(2πιΜ)4μ1 ;10μΜ 的上游引物（SEQ ID No. 1)0·4μ1， 10μΜ 的下游引物（SEQ ID Νο·2)0·4μ1，Εχ Taq0.4yl，DNA 模板 1·5μ1，雙蒸水 3·3μ1。
5. 按照權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于：步驟（2)中所述的PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?95°C 5 分鐘；94°C、10 秒，59°C、20 秒，72°C、60 秒，擴(kuò)增 45 個(gè)循環(huán)；72°C，5 分鐘。
6. 按照權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于：步驟（3)中用Exo I和CIP酶混合體系 純化PCR擴(kuò)增片段。
7. 按照權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于：VK0RC1基因標(biāo)準(zhǔn)序列為SEQ ID No. 3所 不O
8. 按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：標(biāo)準(zhǔn)序列中界定的檢測(cè)位點(diǎn)堿基為SEQ ID No. 3所示的第26個(gè)堿基g。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了檢測(cè)VKORC1基因突變的引物以及應(yīng)用。本發(fā)明首先公開(kāi)了用于檢測(cè)VKORC1基因突變的引物對(duì)，其核苷酸序列為SEQ?ID?No.1和SEQ?ID?No.2所示。本發(fā)明還公開(kāi)了應(yīng)用所述引物對(duì)檢測(cè)VKORC1基因突變的方法，包括：(1)提取待檢測(cè)血液標(biāo)本DNA；(2)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(3)采用Sanger法測(cè)定PCR擴(kuò)增片段序列；(4)用VKORC1基因標(biāo)準(zhǔn)序列與樣本測(cè)序序列比對(duì)，判斷標(biāo)準(zhǔn)序列中界定的檢測(cè)位點(diǎn)堿基與測(cè)序序列對(duì)應(yīng)位點(diǎn)堿基，分析基因突變位點(diǎn)型別。本發(fā)明通過(guò)Sanger法測(cè)序?qū)U(kuò)增片段進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)序列比對(duì)，可直觀讀出檢測(cè)堿基的突變，具有較高的準(zhǔn)確率。
【IPC分類(lèi)】C12N15-11, C12Q1-68
【公開(kāi)號(hào)】CN104561359
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510053744
【發(fā)明人】王宇學(xué)
【申請(qǐng)人】武漢艾迪康醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司
【公開(kāi)日】2015年4月29日
【申請(qǐng)日】2015年2月2日