MicroRNA 221-3p在制備表皮細(xì)胞中的方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種MicroRNA221-3p在促表皮細(xì)胞增殖中 的新用途，也即一種促進(jìn)表皮細(xì)胞增殖的方法，及其將該方法應(yīng)用于制備皮膚移植物。
【背景技術(shù)】
[0002] 皮膚有重要的保障作用，因其位于體表，所以，經(jīng)常發(fā)生皮膚的各種創(chuàng)傷。皮膚 創(chuàng)面修復(fù)是燒創(chuàng)傷治療的重要組成部分，繼各種皮瓣和微粒皮用于移植手術(shù)后，近年來 又興起了表皮細(xì)胞培養(yǎng)和體外構(gòu)建皮膚組織的組織工程技術(shù)，并已成為醫(yī)學(xué)生物工程領(lǐng) 域的研宄熱點（Rhett JM, Ghatnekar GS, Palatinus JA, 0' Quinn M, Yost MJ, Gourdie RG. Novel therapies for scar reduction and regenerative healing of skin wounds. TrendsBiotechnol. 2008Apr ;26(4) :173-80)表皮細(xì)胞分離和培養(yǎng)技術(shù)可為大面積深度燒 傷創(chuàng)面的治療提供充足的皮膚組織細(xì)胞。
[0003] 但是，表皮細(xì)胞體外培養(yǎng)條件苛刻，增殖緩慢，限制了其在臨床治療中的應(yīng)用。體 外培養(yǎng)表皮細(xì)胞以游離方式或組織工程皮膚的方式應(yīng)用于皮膚創(chuàng)面，是以表皮細(xì)胞修復(fù)皮 膚創(chuàng)面的一種新方法。
[0004] MicroRNA(miRNA)是由21-25個核苷酸構(gòu)成的分子，MicroRNA通過抑制其靶分 子mRNA的翻譯或者促進(jìn)其降解而起到負(fù)性基因表達(dá)調(diào)控作用，隨著近年研宄的不斷深 入，人們發(fā)現(xiàn)微小RNA分子在細(xì)胞功能及器官發(fā)育中有著廣泛的作用，如MicroRNA參與 了胚胎的早期發(fā)育過程。在皮膚的發(fā)育過程中，有報道稱miR-205可調(diào)控皮膚干細(xì)胞增 殖（Wang D, Zhang Z, 0'Loughlin E, Wang L, Fan X，Lai EC, Yi R. MicroRNA-205 controls neonatal expansion of skin stem cells by modulating the PI(3)K pathway. Nat Cell Biol. 2013 Oct ;15(10) :1153-63), miR-21 是一種可調(diào)控表皮細(xì)胞中 BMP 的功能 (Ahmed MI, Mardaryev AN, Lewis CJ, Sharov AA, Botchkareva NV. MicroRNA-21 is an important downstream component of BMP signalling in epidermal keratinocytes. J Cell Sci. 2011 Oct 15 ;124(Pt 20) :3399-404.),進(jìn)而調(diào)控表皮細(xì)胞的生長和增殖， MicroRNA-221可抵消或抑制細(xì)胞周期抑制劑p27的作用，從而促進(jìn)肥大細(xì)胞增殖（Mayoral RJ，Pipkin ME，Pachkov M，van Nimwegen E，Rao A，Monticelli S.MicroRNA-221-222 regulate the cell cycle in mast cells. J Tmmunol. 2009 Jan I ; 182 (I):433-45)〇 另 有研宄發(fā)現(xiàn)Micr〇RNA-221-3p和肝細(xì)胞的增殖密切相關(guān)（Yuan Q，Loya K，Rani B，M6bus S,Balakrishnan A, Lamle J, Cathomen T,Vogel A, Manns MP, Ott M, Cantz T,SharmaAD. MicroRNA-221 overexpression accelerates hepatocyte proliferation during liver regeneration. Hepatology. 2013 Jan ；57 (I):299-310)〇
[0005] MicroRNA與細(xì)胞功能的研宄越來越多，但目前尚無 MicroRNA-221-3p過表達(dá)可促 進(jìn)表皮細(xì)胞增殖的研宄及應(yīng)用的文獻(xiàn)報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供Micr〇RNA221-3p的新用途，本發(fā)明的另一目的在于提供 一種促進(jìn)表皮細(xì)胞增殖的方法，本發(fā)明的第三目的在于提供Micr 〇RNA221-3p或者利用 Micr〇RNA221-3p促進(jìn)表皮細(xì)胞增殖的方法在制備組織工程皮膚和皮膚移植物中的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明為了克服表皮細(xì)胞體外培養(yǎng)（制備）中增殖緩慢的缺陷，提高表皮細(xì)胞在 創(chuàng)面修復(fù)中的臨床應(yīng)用效果，提供了借助MicroRNA-具體為Micr 〇RNA221-3p來實現(xiàn)表皮 細(xì)胞快速增殖的新方法。
[0008] 本發(fā)明所述的 MicroRNA221_3p，Accession number :MIMAT0000278,具體序列如 下：
[0009] agcuacauugucugcuggguuuc(SEQ ID NO:1)〇
[0010] 本發(fā)明的第一方面，提供了 MicroRNA221-3p的新用途，即MicroRNA221-3p在制備 促進(jìn)表皮細(xì)胞增殖的試劑中的應(yīng)用。
[0011] 所述的試劑，為提高M(jìn)icroRNA221-3p表達(dá)量的試劑，包括但不限于以下任一：
[0012] A)MicroRNA221-3p ；
[0013] B)含有MicroRNA 221-3p編碼基因的重組載體；
[0014] C)含有MicroRNA 221-3p編碼基因的重組病毒；
[0015] D)含有MicroRNA 221-3p編碼基因的重組病毒載體。
[0016] 所述的MicroRNA221-3p，經(jīng)查找人類基因組數(shù)據(jù)庫，由位于X染色體的基因簇編 碼，其基因序列定位于Xpll. 3。其序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0017] 所述的 MicroRNA 221-3p 前體（MI0000298)，其序列如下：
[0018] UGAACAUCCAG⑶CUGGGGCAUGAACCUGGCAUACAAUGUAGAUUUCUGUGUUCGUUAGGCAACAGCUA CAUUGUCUGCUGGGUUUCAGGCUACCUGGAAACAUGUUCUC(SEQ ID N0:2)。
[0019] 所述的促進(jìn)表皮細(xì)胞增殖，是指體外培養(yǎng)的條件下，通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染或慢病毒感染 的方式上調(diào)表皮細(xì)胞中的MicroRNA 221-3P，和陰性對照相比，MicroRNA221-3p高表達(dá)的 表皮細(xì)胞增殖速度加快。
[0020] 本發(fā)明的第二方面，提供一種促進(jìn)表皮細(xì)胞增殖的方法，該方法包括：構(gòu)建一種 MicroRNA 221-3p高表達(dá)的表皮細(xì)胞。
[0021] 較佳地，該方法包括I )和III )、或者II )和III):
[0022] I )人工合成MicroRNA221-3p的成熟體，經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，獲得MicroRNA 221-3py 高表達(dá)的的表皮細(xì)胞；
[0023] II )構(gòu)建含有MicroRNA221-3p的編碼基因的重組載體、構(gòu)建含有MicroRNA221-3p 的編碼基因的重組病毒，或構(gòu)建含有MicroRNA221-3p的編碼基因的重組病毒載體（簡稱為 GFP-MIR-221-3p);
[0024] 將獲得的重組載體、重組病毒，或重組病毒載體轉(zhuǎn)染表皮細(xì)胞，獲得 MicroRNA221-3p高表達(dá)的表皮細(xì)胞；
[0025] III)步驟I )或II )得到的MicroRNA221-3p高表達(dá)的表皮細(xì)胞，放入37°C 5% 二氧化碳培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基同未做處理的表皮細(xì)胞，均為20%胎牛血清，高糖 DMEM0
[0026] 本發(fā)明在表皮細(xì)胞培養(yǎng)時，采用繪制生長曲線法測量表皮細(xì)胞的增殖速度，發(fā)現(xiàn) Micr〇RNA221-3p高表達(dá)的表皮細(xì)胞，比轉(zhuǎn)染陰性對照的表皮細(xì)胞，增殖速度顯著加快。
[0027] 本發(fā)明的第三方面，提供了 Micr〇RNA221-3p在制備組織工程皮膚和皮膚移植物 中的應(yīng)用，以及或者一種促進(jìn)表皮細(xì)胞增殖的方法在制備組織工程皮膚和皮膚移植物中的 應(yīng)用。
[0028] 本發(fā)明獲得了一種MicroRNA 221-3p高表達(dá)的表皮細(xì)胞（也稱為重組表皮細(xì)胞）， 所述的重組表皮細(xì)胞進(jìn)一步應(yīng)用于制備組織工程皮膚和皮膚創(chuàng)面修復(fù)材料。
[0029] 本發(fā)明提供了一種具有促進(jìn)表皮細(xì)胞增殖的產(chǎn)品（試劑），所述的活性成分為以 下任一：
[0030] A)MicroRNA221-3p ；
[0031] B)含有MicroRNA 221-3p編碼基因的重組載體；
[0032] C)含有MicroRNA 221-3p編碼基因的重組病毒；
[0033] D)含有MicroRNA 221-3p編碼基因的重組病毒載體。
[0034] 本發(fā)明經(jīng)實驗證明，MicroRNA221-3p過表達(dá)后，可抑制PTEN的表達(dá)。PTEN， Phosphatase and tensinhomology，是與細(xì)胞骨架蛋白同源的第10號染色體缺失的磷酸酶 基因，PTEN可抑制表皮細(xì)胞的增殖。本發(fā)明的MicroRNA221-3p過表達(dá)后，通過抑制PTEN 的表達(dá)，可顯著促進(jìn)表皮細(xì)胞的增殖。因此說明，Micr〇RNA221-3p與表皮細(xì)胞增殖有關(guān)， Micr〇RNA221-3p可用于制備表皮細(xì)胞、促進(jìn)表皮細(xì)胞增殖。本發(fā)明克服表皮細(xì)胞體外培養(yǎng) 中增殖緩慢的缺陷，使表皮細(xì)胞可以大量地、低成本地在創(chuàng)面修復(fù)、皮膚移植中得到廣泛的 臨床。
【附圖說明】
[0035] 圖1為熒光顯微鏡觀察慢病毒載體介導(dǎo)GFP-MIR-221-3p在表皮細(xì)胞中的表達(dá)情 況；其中A為GFP-MIR-221-3p轉(zhuǎn)染的表皮細(xì)胞（簡稱為EC high)的明視野，清晰可見表皮細(xì) 胞的形態(tài)；B圖為A圖中EChigh細(xì)胞的暗視野，可見熒光；C為慢病毒空載體轉(zhuǎn)染的表皮細(xì)胞 (簡稱為EC m)的明視野；D為圖為C圖中ECm的暗視野，可見熒光。
[0036] 圖2為計數(shù)法繪制GFP-MIR-221-3p感染后表皮細(xì)胞的生長曲線，測定其增殖能 力?？梢奅C high增殖速度加快。
[0037] 圖3為免疫組化鑒定GFP-MIR-221-3p慢病毒感染后EC中特異性抗原的表達(dá)；其 中A為EC high中廣譜角蛋白的檢測；B為EChigh中角蛋白14的檢測；C為ECne中廣譜角蛋白 的檢測；D為EC ne中角蛋白14的檢測。
[0038] 圖 4 為 western-blot 和 RT-PCR 檢測 MicroRNA221-3p 高表達(dá)后 PTEN 的表達(dá)，其 中A為western-blot的觀察結(jié)果，B圖顯示MicroRNA221_3p表達(dá)增加，C圖顯示PTEN表達(dá) 降低。
[0039] 圖5為GFP-MIR-221-3p感染后表皮細(xì)胞的安全性鑒定。圖中箭頭表示為細(xì)胞移 植部位，大體觀察從左向右依次是A !EChigh移植組，B :EC "移植組，C : EC移植組，D :PBS移 植組。蘇木精-伊紅（HE)染色觀察結(jié)果從左向右依次是E !EChigh移植組，F(xiàn) ^(:^移植組， G :EC移植組，H :PBS移植組。結(jié)果顯示各組致瘤實驗均為陰性；，大體觀察未見異常；HE染 色結(jié)果，也未見畸胎瘤形成。
【具體實施方式】
[0040] 現(xiàn)結(jié)合實施例和附圖，對本發(fā)明作詳細(xì)描述，但本發(fā)明的實施不僅限于此。
[0041] 本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得或可按文獻(xiàn)方法制備。下列實施例中未注明 具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人《分子克?。簩嶒炇抑改稀罚∟ew York :Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照常規(guī)條件，或 按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。
[0042] 實施例1 :穩(wěn)定高表達(dá)Micr〇RNA221-3p的表皮細(xì)胞的獲得
[0043] -、表皮細(xì)胞獲得
[0044] 成人體皮來自長海醫(yī)院整形外科。原代培養(yǎng)得到表皮細(xì)胞。
[0045] 取包皮后將其裝在含有無菌PBS或者DMEM培養(yǎng)基的無菌離心管內(nèi)，盡快操作。在 無菌培養(yǎng)皿內(nèi)以適量75%乙醇酒精棉球反復(fù)擦拭包皮1分鐘左右。將包皮換到另一個無菌 培養(yǎng)皿中，用含雙抗磷酸鹽緩沖液Phosphate Buffered Saline(PBS)液（青、鏈霉素濃度 均為lOOIU/ml)徹底清洗，盡量剪去皮下組織，PBS液洗兩遍。將皮片剪切成l-2mm寬的條 狀，浸泡于約5倍于組織的0. 25% Dispase酶液中，4°C消化16-18小時。從取出皮片上輕 輕撕離表皮，雙抗PBS洗兩遍。加入適量預(yù)熱至37°C的胰酶消化液（